层析技术介绍

1、层析技术,（chromatography）,一、简介,1、层析法也称色谱法，是1906年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”（Chromatography) 。后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。,2、层析法是目前广泛应用的一种分离技术，是分离各种生物大分子的主要手段之一，是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术。,3、40年代：两位英国科学家Martin和Synge发明了分配色谱（层析），他们首先提出了色谱塔板理论，获得了1952年的诺贝尔化学奖。由此，层析技

2、术成为分离生化物质的关键技术。,4、按照不同的标准层析法有不同的分类。根据层析峰的位置及峰高或峰面积,可以定性及定量。层析法与光学、电学或电化学仪器连用，可检测出层析后各组份的浓度或质量，同时绘出层析图。层析仪与电子计算机联用，可使操作及数据处理自动化，大大缩短分析时间。,5、由于层析法具有分辨率高、灵敏度高、选择性好、速度快等特点，因此适用于杂质多、含量少的复杂样品分析，尤其适用于生物样品的分离分析。近年来，已成为生物化学及分子生物学常用的分析方法。在医药卫生、环境化学、高分子材料、石油化工等方面也得到了广泛的应用。,6、在层析法实验技术有凝胶层析法、离子交换层析法、高效液相层析法、亲和层析

3、法、聚焦层析法等,二、原理及概念,层析技术是一类物理分离方法,根据待分离混合物中各组分物理化学性质的差别,使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中,由于各组分随流动相前进的速度不同,从而得到有效分离。,例如：我们利用物质在溶解度、吸附能力、立体化学特性及分子的大小、带电情况及离子交换、亲和力的大小及特异的生物学反应等方面的差异，使其在流动相与固定相之间的分配系数（或称分配常数）不同，达到彼此分离的目的。,层析系统都由两个相组成：一是固定相，它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分；另一是流动相，即可以流动的物质，当待分离的混合物通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互

4、作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，与固定相相互作用力越弱的组份，随流动相移动时受到的阻滞作用小，向前移动的速度快。反之，与固定相相互作用越强的组份，向前移动速度越慢。分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，从而达到将各组份分离的目的。,基本概念,固定相：固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。,流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄

5、层层析时称为展层剂。,分配系数（distribution coefficient）,分配系数是指在一定的条件下（如温度、压力），某种组分在固定相和流动相中含量（浓度）的比值，分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据，常用K来表示,Cs: 溶质在固定相中的浓度，Cm:溶质在流动相中的浓度,K值大表示其溶质在固定相中浓度大， 在洗脱过程中溶质出现较晚,K值小表示某溶质在流动相中浓度 大，故在洗脱液中出现较早,有相似的K值，则表明两组分层析峰 会发生重叠，分离效果差,分配系数主要与下列因素有关：,被分离物质本身的性质,固定相和流动相的性质,层析柱的温度。,不同的层析机理，其K值函义不同:,吸附层析中K

6、值表示吸附平衡常数 分配层析中K值表示分配系数 离子交换层析中K表示交换常数 亲和层析中K表示亲和常数。,迁移率（ Rf或比移值）是指：在一定条件下，在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值 。常用Rf来表示,迁移率,实验中我们还常用相对迁移率的概念。相对迁移率是指：在一定条件下，在相同时间内，某一组分在固定相中移动的距离与某一标准物质在固定相中移动的距离之比 值。常用Rx来表示,分配系数与迁移率的关系,K值大，就表明该组分与固定相结合力大，迁移率小； 反之则结合力小，迁移率大,K增加，Rf减少；反之，会减少，Rf增加,不同物质的分配系数或迁移率是不同的。分配系数

7、或迁移率的差异程度是决定几种物质采用层析方法能 否分 离的先决条件。其差异越大，分离效果越理想。,操作容量：在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量。每克（或毫升）基质结合某种成分的毫摩尔数（或毫克数）。 数值大，结合力强。 膨胀度（V)： 在一定溶液中，单位重量的基质充分溶胀后所占有的体积；即每克溶胀基质所具有的床体积。 床体积（Vt),三、分类,1、按两相所处状态分类,2、按层析原理分类,3、按操作形式不同分类,凝胶层析 （gel chromatography）,凝胶排阻层析（gel exclusion chromatography） 分子筛层析（molecula

8、r sieve chromatography） 凝胶过滤（gel filtration） 凝胶渗透层析（gel permeation chromatography）,凝胶层析的定义：,凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。利用这种凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，称凝胶层析 。,葡聚糖凝胶（dextran） 聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide） 琼脂糖凝胶（agarose） Sephacryl Superdex 聚苯乙烯凝胶,一、凝胶的种类和性质,1.葡聚糖凝胶 葡聚糖凝胶（Sephadex）是指由葡聚糖与其它交联剂交联而成的凝胶。具有良好的化学稳定性，是目前生化产品制备

9、中最常用的凝胶。,G类葡聚糖凝胶（Sephadex-G）的最基本骨架是葡聚糖，它是一种以右旋葡萄糖为残基的多糖，分子间主要是-1,6-糖苷键（约占95%），分枝为l，3-糖苷键（约占5%），以1-氯-2，3-环氧丙烷（见下式） 为交联剂将链壮结构连接为三维空间的网状结构的高分子化合物,交联度由环氧氯丙烷的百分比控制,葡聚糖凝胶网孔大小可通过调节交联剂和葡聚糖的配比及反应条件来控制。交联度越大，网孔越小，吸水膨胀就越小。交联度越小，网孔越大，吸水膨胀就越大 。,G类葡聚糖凝胶常用G-X代表，X数字既代表交联度，也代表持水量（吸水率）乘以10（单位是mL/g干胶）,如G-25表示1g干胶持水2.5

10、mL，吸水率是2.5mL/g干胶；G-100表示 1g干胶持水10mL，依次类推。 X数字越小，交联度越大，网孔越小，适用于分离低分子质量生化产品。X数字越大，交联度越小，网孔越大，适用于分离高分子生化产品。,2. 聚丙烯酰胺凝胶,聚丙烯酰胺凝胶也是一种人工合成凝胶，其商品名为生物凝胶P（Bio-gel-P），和交联葡聚糖一样，为颗粒状干粉，在溶剂中能自动吸水溶胀成凝胶。其由单体丙烯酰胺,和交联剂甲叉双丙烯酰胺,通过自由基引发聚会形成聚丙烯酰胺凝胶。,只要控制单体用量和交联剂的比例，就能得到不同型号的凝胶,像Sephadex一样，商品聚丙烯酰胺为颗粒状的干粉，它有十分明显形成块状并粘附在一起的

11、倾向，在溶剂中能自动溶胀成胶。,根据聚丙烯酰胺凝胶的溶胀性质和分离范围的不同，可分成10种类型。各种类型均以英文字母P和阿拉伯数字表示，从Bio-Gel P-2至Bio-Ge1 P-300。P后面的阿拉伯数字乘以1000即相当于排阻限度（按球蛋白或肽计算），所以数字越大，可分离的分子量也就越大目前。,琼脂糖凝胶（Sepharose）,琼脂糖凝胶（agarose gel）可以分离葡聚糖凝胶和生物胶所不能分离的大分子，使凝胶层析的分离区间扩大到大分子和病毒颗粒，其最大范围可达相对分子质量108，其结构是由-D-吡喃半乳糖和3，6脱水-L-吡喃半乳糖相结合的链状多糖。它既具有琼脂凝胶相同的分离区间，

12、又没有吸附作用。但其稳定性远不如葡聚糖凝胶和生物胶P，强酸强碱能引起结构破坏。最好使用条件控制在pH 49之间，温度040。,对样品的吸附作用很小 琼脂糖凝胶的机械强度和孔穴的稳定性都很好， 在高盐浓度下，柱床体积一般不会发生明显变化，使用琼脂糖凝胶时洗脱速度可以比较快 排阻极限很大，分离范围很广，适合于分离大分子物质，但分辨率较低 琼脂糖凝胶不耐高温，使用温度以030C为宜,二、凝胶层析的基本原理,凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的 凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。 当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向

13、固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。,l 分子大小不同混合物上柱； 2 洗脱开始，小分子扩散进人凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外；3 大小分子分开： 4大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中,几个概念：,外水体积、内水体积、基质体积、柱床体积、洗脱体积,对某物质在凝胶柱内洗脱体积Ve、Vo和Vi之间的关系可用下式表示：,VeVoKd.Vi,可改写为：,（Ve-Vo） Kd = Vi,当Kd0时，Ve=Vo，说明这种溶质相对分子质量大，完全不能进入凝胶颗粒微孔内，被排阻于凝胶颗粒之外而最先洗脱下来；,当Kd1时，即Ve小分子 VoVi= Vt ，说明这种

14、溶质的相对分子质量小，完全向凝胶颗粒内扩散，在洗脱过程中将最后流出柱外。,当0Kdl时，意味着溶质分子只有部分向凝胶颗粒内扩散，Kd愈大，进入凝胶颗粒内的程度愈大,分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介于二者之间。,对于凝胶层析，分配系数实质上表示某个组分在内水体积和在外水体积中的浓度分配关系。在凝胶层析中，分配系数通常表示为： Kav=(Ve-V0)/(Vt-V0),于某一型号的凝胶，在一定的分子量范围内，各个组分的Kav与其分子量的对数成线性关系： Kavblg MWc,凝胶层析的分配系数,排阻极限是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。 排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大

15、分子量，大于这种凝胶的排阻极限的分子用这种凝胶不能得到分离 例如Sephadex G-50的排阻极限为30,000，它表示分子量大于30,000的分子都将直接从凝胶颗粒之外被洗脱出来。,排阻极限,吸水率和床体积 吸水率是指1g干的凝胶吸收水的体积或者重量，但它不包括颗粒间吸附的水份 床体积是指1g干的凝胶吸水后的最终体积。,凝胶颗粒的大小通常以目数（mesh）或者颗粒直径（mm）来表示 柱子的分辨率和流速都与凝胶颗粒大小有关 颗粒大，流速快，但分离效果差；颗粒小，分离效果较好，但流速慢 一般比较常用的是100200目,三、凝胶的选择、处理和保存,1. 凝胶的选择,选择适宜的凝胶是取得良好分离效

16、果的最根本的保证。选取何种凝胶及其型号、粒度，一方面要考虑凝胶的性质，包括凝胶的分离范围（渗入限与排阻限）还有它的理化稳定性、强度、非特异吸附性质等；另一方面还要注意到分离目的和样品的性质。,凝胶粒度与洗脱效果的关系图,对生物样品来说，经常遇到的是两种分离形式。 一种是只将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白样品的脱盐或蛋白、核酸溶液去除小分子杂质以及一些注射剂去除大分子热源物质等等，称作类分离或组分离。 另一类则是要将分子量相差不很大的大分子物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分离。后者对实验条件和操作要求都比较高,组分离时要选择能将大分子完全排阻而小分子完全渗透的凝胶，这样分

17、离效果好。一般常用排阻极限较小的凝胶类型 例如从蛋白质溶液中除去无机盐。我们知道，蛋白质的分子量都大于5000D，而无机盐的分子量一般在几十到几百之间。所以常选用Sephadex G-25凝胶作为分离固定相，因为它的分离范围是10005000D。 对于分子量小于5000D的肽类进行脱盐操作则常选用Sephadex G-15凝胶。,分级分离时则要根据样品组分的具体情况来选择凝胶的类型，凝胶的分离范围一方面应包括所要的各个组分的分子量，另一方面要合适，不能过大 选择凝胶型号时必须使各种物质的Kd值尽可能相差大一些。Kd不要都接近于0或1。如果样品中含有3个组分的话，最好一个接近全排阻，另一个接近全

18、渗入，第三个为部分渗入。分子量如与渗入限比较靠近，该组分分子在凝胶颗粒中运动所受的约束很小，不易与低分子组分分开。如分子量与排阻限比较靠近则不易与高分子组分分开。,不同分离范围的葡聚糖凝胶上，血清蛋白的层析图,凝胶使用前要首先要进行处理。选择好凝胶的类型后，首先要根据选择的层析柱估算出凝胶的用量 干胶用量（g）柱床体积（ml）/ 凝胶的床体积（ml / g） 由于凝胶处理过程以及实验过程可能有一定损失，所以一般凝胶用量在计算的基础上再增加1020。,凝胶的处理,葡聚糖凝胶和生物胶多以干粉形式保存，使用前需用水或洗脱缓冲液充分溶账。较快的做法是将干胶往水里加，边加边搅，以防凝胶结块，然后放到沸水

19、浴中加热接近100，几个小时就可以使其溶胀，还可起到除去颗粒内部气泡和杀菌作用。但应注意尽量避免在酸或碱中加热，以免凝胶被破坏,琼脂糖凝胶和有些市售凝胶是水悬浮的状态，所以不需膨化处理,膨化处理后，要对凝胶进行纯化和排除气泡 纯化可以反复漂洗，倾泻去除表面的杂质和不均一的细小凝胶颗粒。 排除凝胶中的气泡是很重要的，否则会影响分离效果，可以通过抽气或加热煮沸的方法排除气泡 。,1. 层析柱的选择 层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要求来进行选择。 层析柱的长度对分辨率影响较大，长的层析柱分辨率要比短的高。（P102,图6-5） 层析柱长度不能过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等。,

20、三 凝胶层析的基本操作,新柱装好后，要用洗脱缓冲液平衡，一般用35倍体积的缓冲液在恒压下流过柱床。,新装好的柱要检验其均匀性可用带色的高分子物质如蓝色葡聚糖-2000配成2mg/mL的溶液过柱，观察色带是否均匀下降。也可以对光检查，看其是否均匀或有无气泡存在。,凝胶柱的鉴定,在凝胶层析中流动相只是起运载工具的作用，一般不依赖于流动相性质和组成的改变来提高分辨率 凝胶层析洗脱液的选择主要取决于待分离样品，一般来说只要能溶解被洗脱物质并不使其变性的缓冲液都可以用于凝胶层析。为了防止凝胶可能有吸附作用，一般洗脱液都含有一定浓度的盐。,洗脱液的选择,一般分级分离时加样体积约为凝胶柱床体积的15左右 而

21、分组分离时加样体积可以较大，一般约为凝胶柱床体积的1025。 样品的粘度不能过大，否则会影响分离效果。,加样量,样品黏度对洗脱曲线的影响,（1）终浓度为5%，相对粘度11.8; （2）终浓度为2.5%，相对粘度4.2; （3）使终浓度为1%.,流速对洗脱曲线的影响,凝胶保存方法,湿态保存：在水相中加防腐剂，或水洗到中性，高压灭菌封存（或低温存放）；然后加入适当的抗菌剂，通常加入0.02的叠氮化钠，4 C下保存。,半收缩保存：水洗后滤干，加70乙醇使胶收缩，再浸泡于70乙醇中保存；,干燥保存：水洗后滤干，依次用50、70、90、95乙醇脱水，再用乙醚洗去乙醇，干燥(或6080烘干）后保存。加乙醇

22、时，切忌一上来就用浓乙醇处理，以防结块。,1、生物大分子的纯化凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯 2. 分子量测定 在一定的范围内，各个组分的Kav以及Ve与其分子量的对数成线性关系。 Kavb lg MWc Veb lg MWc,五、 凝胶层析的应用,3. 脱盐及去除小分子杂质 4. 去热源物质 5. 溶液的浓缩,离子交换层析,一、原理,离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。离子交换层析的固定相是离子交换剂，液体为流动相。,离子交换层析原理示意图,纤维素OCH2COO-Na+,离子交换剂是由基质、电荷基团（或功

23、能基团）和反离子构成。,基质 电荷基团 反离子,羧甲基纤维素离子交换剂组成示意图,离子交换基团不但可结合到纤维上， 还可结合到交联葡聚糖（S-ephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）上。 近年来离子交换色谱技术已经广泛应用于蛋白质、酶、核酸、肽、寡核苷酸、病毒、噬菌体和多糖的分离和纯化。,离子交换剂通常是一种不溶性高分子化合物，如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等，它的分子中含有可解离的基团，这些基因在水溶液中能与溶液中的其它阳离子或阴离子起交换作用。 物质的离子交换过程有两个阶段吸附和解吸附。 虽然交换反应都是平衡反应，但在层析柱上进行时，由于连续添加新的交换溶液，平衡不断按正方向进行

24、，直至完全。因此可以把离子交换剂上的原子离子全部洗脱下来。,离子交换色谱的分配过程是交换与洗脱过程。交换达到平衡时：,K值是反映离子交换剂对不同离子的结合力或选择性的参数，所以称K值为离子交换剂对B+、A+的选择系数,离子交换层析之所以能成功地把各种无机离子、有机离子或生命大分子物质分开，其主要依据就是离子交换剂对各种离子或离子化合物有不同的结合力。,或者说不同物质在同一离子交换剂上的选择系数是不同的,但更多的是通过增加离子强度，使加入的离子与物质竞争离子交换剂上的电荷位置，使吸附的物质与离子交换剂解开。,不同物质与离子交换剂之间形成电键数目不同，即亲和力大小有差异 ，因此只要选择适当的洗脱条

25、件便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。,对于呈两性离子的蛋白质、酶类、多肽和核苷酸等物质与离子交换剂的结合力，主要取决于它们的物理化学性质和在特定pH条件下呈现的离子状态，由此可以通过调节pH值来改变它们的结合力或选择不同类型的交换剂,二、离子交换的分类,实用的离子交换剂应满足的要求： 有高度的不溶性，在各种溶剂中进行交换时，不 发生溶解 有疏松的多孔结构或巨大的表面积，使交换离子 能在交换剂中进行自由扩散和交换 有较多的交换基团 有稳定的物理化学性质，在使用过程中，不因物 理或化学因子的变化而发生分解或变形等现象,分为阳离子交换剂(cation exchange)（含酸性基

26、团）和阴离子交换剂(anion exchange)（含碱性基团）。 各类交换剂根据其解离性大小，具体又可以分为： 强、中、弱阳和强、中、弱阴,1、按活性基团分类：,2、按交换剂中基质的组成和性质分：,（1）疏水性离子交换剂 基质是一种人工合成的、与水结合力较小的树脂物质。 常用的是苯乙烯和二乙烯苯合成的聚合物 （2）亲水性离子交换剂 基质是一类天然的或人工合成的、与水结合力较大的物质。 常用的有纤维素、交联葡聚糖 等,疏水性离子交换剂，以引入电荷基团的性质又分为：,阳离子交换树脂(包括： 强、中、弱） 阴离子交换树脂(包括： 强、中、弱) 鳌合离子交换树脂（对金属离子有较强的选择性）,a、阳离

27、子交换树脂,交联剂的电荷基团带负电，反离子带正电,强酸性阳离子交换树脂：R-SO3H（磺酸基）和R-CH2SO3H（次甲基磺酸基）R代表基质（树脂） 中酸性阳离子交换树脂：R-PO3H2，R-POH2 弱酸性阳离子交换树脂：R-COOH，R-OCH2COOH，R-C6H5OH等弱酸性基团；,强酸性：R-SO3 -H+ Na+ R-SO3- Na+ H+弱酸性：R-COOHNa+ R-COONa H+,b、阴离子交换树脂,阴离子交换剂中引入的是伯胺、（-NH2）、仲胺（-NHCH3）、叔胺N-（CH3）2和季胺-N（CH3）2等硷性基团。 强碱性阴离子交换树脂：活性基团为季胺基团，如三甲胺基或二

28、甲基-羟基乙基胺基 中碱性阴离子交换树脂：活性基团为叔胺基团 弱碱性阴离子交换树脂：活性基团为伯胺或仲胺 R-N+(CH3)3OH- Cl- R-N+(CH3)3Cl-OH- 强硷性201号国产树脂和国外Dowex1、Dowex2、ZerolitFF等都属于强硷型阴离子交换剂。,疏水性离子交换剂的特点： 含大量的活性基团、交换容量高、机械强度大、流动速度快 主要分离无机离子、有机酸、核苷等小分子物质 其次用于从蛋白质溶液中除表面活性剂、两性电解质等 也可用于分离某些不易变性的蛋白质,亲水性离子交换剂,根据基质性质分为：,a、纤维素离子交换剂 树脂骨架为纤维素，根据活性基团的性质可分为阳离子交换

29、纤维素和阴离子交换纤维素两类。 特点：骨架松散、亲水性强、表面积大、交换容量大、吸附力弱、交换和洗脱条件温和、分辨率高 常用的有：甲基磺酸纤维素、羧甲基纤维素（CMC）、二乙基氨基乙基纤维素（DEAE）,骨架为交联葡聚糖G-25或G-50，根据功能基团的不同，亦可分为阳离子交换和阴离子交换树脂 命名方法：交换活性基团+骨架+原骨架编号 特点：除了具有离子交换功能以外，兼有分子筛的功能，提高了分离的效率 常用：CM-sephadex C-25、DEAE-sephadex A-50等,b、交联葡聚糖离子交换剂,是将电荷基团（DEAE-或CM-等基团）附着在Sepharose CL-6B 上形成，如

30、： DEAE-Sepharose（阴离子） CM-Sepharose（阳离子） 具有硬度大， 性质稳定，凝胶后的流速好，分离能力强等优点。,c、琼脂糖离子离交换剂：,性质,1、颜色、形状珠状,2、交联度是表示离子交换树脂中交联剂的含量 交联度越大,凝胶的网结构愈紧密,吸水后膨胀愈小,能分离的分子量越小,反之交联度越小,网状结构愈疏松,吸水后膨胀愈大,3、吸水量或膨胀度：离子交换树脂含有大量亲水基团，与水接触即吸水膨胀。测定膨胀前后树脂的体积比，可得出膨胀度。 与基质和电荷基团的性质及溶液的pH值和离子强度密切相关。,4、交换容量：指离子交换剂与溶液中离子或离子化合物进行交换的能力。交换容量是表

31、征树脂交换能力的重要参数，其表示方法有质量交换容量（mmol/g干树脂）和体积交换容量（mmolmL树脂） 它又有“总交换容量”、“工作（有效）交换容量”和“再生交换容量”等三种表示方式。,总交换容量，表示每单位数量(重量或体积)树脂能进行离子交换反应的化学基团的总量。-与本身性质有关，不受测试条件影响 工作交换容量，表示树脂在某一定条件下的离子交换能力，它与树脂种类和总交换容量，以及具体工作条件如溶液的组成、流速、温度等因素有关。,5、流速： 离子交换层析过程的流速一般是由离子交换剂的性质、操作压、层析柱体积和分离样品的要求等因子控制。 流速常用体积流速（mL/h）或线性流速（cm/h）表示

32、。 交换剂颗粒大，流速快 洗脱液黏度大，流速慢 适当的流速可以提高层析的分离效果,6、稳定性 7、比重,（三）、离子交换剂与缓冲液的选择,提高有效成分的得率与分辨率,（1）、阴、阳离子交换剂的选择 （2）、强、弱离子交换剂的选择 （3）、不同离子型交换剂的选择 （4）、不同载体离子交换剂的选择,1、离子交换剂的选择,选用的平衡溶液的pH和离子强度等能使样品中有效成分与离子交换剂进行结合，而不能或较难与样品中杂质与离子交换剂结合。 或选用的平衡溶液的pH和离子强度，只能使有效成分与离子交换剂进行松散结合，而杂质与离子交换剂可牢固结合。 关键在于了解有效成分的等电点。,2、缓冲液的选择,新出厂的树

33、脂是干树脂，要用水浸透使之充分吸水膨胀。因其含有一些杂质，所要要用水、酸、硷洗涤。一般手续如下：新出厂干树脂用水浸泡2 小时后减抽压去气泡，倾去水，再用大量无离子水洗至澄清，去水后加4倍量2N HCl搅抖4小时，除去酸液，水洗到中性，再加4倍量2N NaOH搅抖4小时，除硷液，水洗到中性备用。,（四）交换剂的处理，再生与转型,对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。将树脂带上所希望的某种离子的操作称为转型。 阴离子交换剂常用“碱-酸-碱”处理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂； 阳离子交换剂则用“酸-碱-酸”处理，使最终转为-

34、H+型交换剂。 用过的树脂使其恢复原状的方法称为再生。并非每次再一都用酸、硷液洗涤，往往只要转型处理就行了。,离子交换剂的再生 离子交换剂可在柱上再生。如离子交换纤维素可用2mol/:NaCl淋洗柱，若有强吸附物则可用0.1mol/l NaOH洗柱；若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生，也可用乙醇洗涤，其顺序为：0.5mol/l NaOH-水-乙醇-水-20NaOH-水。,洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度。已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。柱子装好后再用起

35、始缓冲液淋洗，直至达到充分平衡方可使用。,（五）装柱,加样：层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度，所选定的pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围，同时要注意离子强度应低，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去。 为了达到满意的分离效果，上样量要适当，不要超过柱的负荷能力。柱的负荷能力可用交换容量来推算，通常上样量为交换剂交换总量的1-5。,（六）加样与洗脱,已结合样品的离子交换前，可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱，也可同时改变pH与离子强度。 为了使复杂的组份分离完全，往往需要逐步改变pH或离子强度，其中最

36、简单的方法是阶段洗脱法，即分次将不同pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。由于这种洗脱pH与离子强度的变化大，使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱，纯度较差，不适宜精细的分离。,洗脱：,最好的洗脱方法是连续梯度洗脱，两个容器放于同一水平上， 第一个容器盛有一定pH的缓冲液，第二个容器含有高盐浓度或不同pH的缓冲液；第一个容器与柱相连，两容器连通； 当溶液由第一容器流入柱时，第二容器中的溶液就会自动来补充，经搅拌与第一容器的溶液相混合，这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化。,洗脱时应满足以下要求： 洗脱液体积应足够大，一般要几十倍于床体积，从而使分离的各峰不致于太拥挤。 梯度的上限要足

37、够高，使紧密吸附的物质能被洗脱下来。 梯度不要上升太快，要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态。目的物的过早解吸，会引起区带扩散；而目的物的过晚解吸会使峰形过宽。,用来分离离子或可离解的化合物，凡是在流动相中能够电离的物质都可以用离子交换色谱法进行分离 广泛地应用于：无机离子、有机化合物和生物物质(如氨基酸、核酸、蛋白质等)的分离及测定蛋白质的等电点。,离子交换色谱法的应用,亲和层析 （affinity chromatography）,亲和层析是利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离目的的一类特殊层析技术。,在生物体内，许多大分子具有与某些相对应的专一分子可逆结合

38、的特性。例如抗原和抗体、酶和底物及辅酶、激素和受体、RNA和其互补的DNA等，都具有这种特性。生物分子之间这种特异的结合能力称为亲和力。,具有专一亲和力的生物分子对主要有：抗原与抗体、DNA与互补DNA或RNA、酶与它的底物或竞争性抑制剂、激素（或药物）与它们的受体、维生素和它的特异结合蛋白、糖蛋白与它相应的植物凝集素等。,亲和色谱中两个进行专一结合的分子互称对方为配基。如抗原和抗体，抗原可认为是抗体的配基，反之抗体也可认为是抗原的配基。将一个水溶性配基在不伤害其生物学功能的情况下与水不溶性载体结合称为配基的固相化。,欲分离的大分子物质S和相对应的专一物质L（配体）以次级键结合，能生成一种可解

39、离的络合物L-S，其中的L又能与活化的基质M以共价键首先结合，而形成M-L-S复合物。根据L-S之间能可逆地结合与解离的原理发展起来的层析方法称为亲和层析。,亲和层析是利用配基、配体之间专一可逆结合性质进行物质分离的方法,因此其专一性、选择性是极高的。 柱体积小，上样量大，洗脱流速快，操作步骤少 缺点是要分离一种物质必须找到适宜的配体，并将其制成固相载体之后方可进行,1、选 择 配 基； 2、选择偶联凝胶； 3、偶 联 配 基； 4、装填合适的柱； 5、平衡（2-3倍体积缓冲液）； 6、应 用 样 品； 7、洗涤未结合物质； 8、洗脱结合物质除盐； 9、再生；,一般推荐使用的程序如下：,吸附层

40、析 （absorption chromatography）,任何两个相都可以形成表面，其中一个相的物质或溶解在其中的溶质在此表面密集现象称为吸附，利用吸附剂对不同物质具有不同吸附力使混合物得到分离的现象就叫吸附层析 是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法,吸附解吸再吸附再解吸无数次洗脱分开,凡能将其他物质聚集到自己表面的物质称吸附剂,包括硅皮,氧化铝,活性炭,淀粉,纤维素及陶土;而聚集于吸附剂表面的物质称被吸附剂. 吸附剂与被吸附剂之间的作用除了物理作用外,还有化学作用,如DNS-氨基酸双向聚酰胺薄膜层析中被分离的物质之所以能吸附在聚酰胺薄膜上就是由于二者之间形

41、成氢键.,常用术语：（p37-38） 固定相，流动相，层析，操作容量，床体积，洗脱体积 外水体积，内水体积，基质体积，膨胀度， 分配系数和迁移率,吸附剂： 吸附剂的选择主要依据吸附剂本身和被吸附物质的理化性质进行选择，极性强的易吸附极性强的物质，非极性的易吸附非极性的物质。 吸附剂的活化，使用前需要活化，如硅胶，可在高温烘烤,1、吸附柱层析 2、薄层层析（TLC）：是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，液体为流动相的一种层析方法。 特点： 展开时间短 设备简单、操作方便 温度变化和溶剂饱和度对Rf值影响较小 可使用腐蚀性显色剂 灵敏度高,分类：,聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被

42、分离物之间形成氢键。这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能导致分离物质达到分离目的。,聚酰胺薄膜层析,聚焦层析是一种操作简单、廉价的层析技术。它的原理是根据各种蛋白质的等电点不同进行分离的过程，因此本方法具有高分辨、高度浓缩和高度专一等特点。 聚焦层析所用的凝胶首先用高pH溶液平衡，然后用多元缓冲液进行洗脱，多元缓冲液pH呈梯度下降。,聚焦层析,聚焦层析所用凝胶主要有两种：MONOP和多元缓冲液交换剂（PBE）。其中MONOP是带孔小珠，孔中被带正电荷的胺基填充，适用于高效聚焦层析。多元缓冲液交换剂是一种交换凝胶，适用作普通聚焦层析的介质。,聚焦层析也是一种柱层析。因此，它和另外的层析一样，照例具有流动相，其流动相为多缓冲剂