工学]基因工程第2章 酶学基础2DNA连接酶.ppt

1、第二章 基因工程的酶学基础,第二节 DNA连接酶,2.1 DNA连接酶的发现(P21),1967年，世界上有数个实验室几乎同时发现了一种能够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶(ligase)。 这种酶需要在一条DNA链的3-末端具有一个游离的羟基(-OH)，和在另一条DNA链的5-末端具有一个磷酸基团(-P)，只有在这种情况下，才能发挥其连接DNA分子的功能作用。,在大肠杆菌及其它细菌中，DNA连接酶催化的连接反应，是利用NAD烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化型)作能源的； 而在动物细胞及噬菌体中，则是利用ATP腺苷三磷酸作能源。,DNA连接酶并不能够连接两条单链的DNA分子或

2、环化的单链DNA分子，被连接的链必须是双螺旋的一部分。实际上，DNA连接酶是封闭双螺旋DNA骨架上的切口(nick)，即在双链DNA的某一条链上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂。,2.2 DNA连接酶的基本性质,修复双链DNA上切口处的磷酸二酯键,nick,nick,修复与RNA链结合的DNA链上切口处的磷酸二酯键,5G-C-U-C-U-G-C-A-G-G-A-G 3,3C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5,P OH,nick,连接多个平头双链DNA分子,2.3 分类（P21）,1U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 反应1 小时，完全连接1g-DN

3、A（HindIII片段）所需的酶量,2.4 DNA连接酶的反应体系,某植物表达载体的连接体系,连接酶连接切口DNA的最佳反应温度是37。但是在这个温度下，黏性末端之间的氢键结合是不稳定的。因此，连接黏性末端的最佳温度，应是界于酶作用速率和末端结合速率之间，一般认为415比较合适。 平末端的连接采用T4DNA聚合酶，可在较高的温度进行，如22 。,同种内切酶产生的黏性末端的连接 同尾酶产生的黏性末端的连接 不同黏性末端的连接,2.5 体外连接DNA片段的方式（P130-135）,黏性末端,平末端的直接连接 末端修饰后的连接 加上连杆（ linker ），使之形成黏性末端后，再用DNA连接酶连接

4、DNA接头(adapter)连接法,具黏性末端的DNA片段的连接比较容易，也较常用。,2.5.1同种内切酶产生的黏性末端的连接,T4DNA连接酶,退火,2.5.2同尾酶产生的黏性末端的连接,T4DNA连接酶,退火,2.5.3不同黏性末端的连接,2.5.4平末端的直接连接,从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的黏性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多 提高平头末端连接效率的方法包括： 加大连接酶用量（10倍于黏性末端的连接） 加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会 加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用 加入单价阳离

5、子（NaCl），最终浓度150-200 mM,2.5.4平末端的连接,（1）直接用T4DNA连接酶连接； （2）先用末端核苷酸转移酶，给平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA连接酶进行连接； （3）用连杆连接平末端DNA分子； （4）DNA接头连接法。,直接用T4DNA连接酶连接平末端,2.5.5末端修饰后的连接,DNA片段末端同聚物加尾后连接（用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）给具平末端的DNA片段加上poly(dA)、 poly(dT)、 poly(dC)、 poly(dG)尾巴之后，再用DNA连接酶将它们连接起来） P133 黏性末端修饰成平末端后再连接,DNA片段末端同聚物加尾后连

6、接,3突出末端,PstI,SphI,PstI酶切位点,黏性末端修饰成平末端后再连接,EcoRI,BamHI,BamHI酶切位点,5突出末端,2.5.6 加上连杆后再连接(P133),如果重组体DNA是用平末端连接或是用同聚物加尾构建的，那么很可能无法用原来的限制酶作特异的切割，因此也不能获得插入DNA片段。为了解决这个问题，可采用连杆法提供必要的序列，进行DNA分子的连接。 所谓连杆(1inker)，是指用化学方法合成的一段由1012个核苷酸组成的、具有一个或数个限制酶识别位点的寡核苷酸片段。 DNA片段末端加上化学合成的连杆，能形成黏性末端，连接后可用内切酶进行切割。,连杆的5-末端和待克隆

7、的DNA片段5-末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后再通过T4DNA连接酶的作用使两者连接起来。接着用适当的限制酶消化具有连杆的DNA分子和克隆载体分子，这样的结果使二者都产生出了彼此互补的黏性末端。于是便可以按照常规的黏性末端连接法，将待克隆的DNA片段同载体分子连接起来。,DNA连杆连接法尽管有诸多方面的优越性，但也有一个明显的缺点，那就是如果待克隆的DNA片段或基因的内部，也含有与所加的连杆相同的限制位点，这样在酶切消化连杆产生黏性末端的同时，也就会把克隆基因切成不同的片段，从而为后继的亚克隆及其它操作造成麻烦。 当然，在遇到这种情况时，一个方法可改用其它类型的连杆，另一种公认的较好

8、的替代办法是改用DNA接头(adapter)连接法。,2.5.7 DNA接头(adapter)连接法 (P134),于1978年由康乃尔大学吴瑞教授发明的。它是一类由人工合成的一头具有某种限制性内切酶粘末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸片段。当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接之后，便会使后者成为具黏性末端的新的DNA分子，而易于连接重组。,吴瑞（1928-2008）,2008年2月10日，吴瑞教授在康奈尔大学去世。,2008年3月14日出版的science以“桥”为题，撰文纪念吴瑞教授。,吴瑞创建了中美生物化学联合招生项目（CUSBEA），1982年至1989年间，该项目共招收了4

9、00余位顶尖的中国学生来美学习研究生课程。 http:/ 科学网专题：深切缅怀吴瑞教授http:/,小结：平末端DNA片段的连接,（1）直接用T4DNA连接酶连接； （2）先用末端核苷酸转移酶，给平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA连接酶进行连接； （3）用连杆连接平末端DNA分子； （4）DNA接头连接法。,PCR产物的连接（P135）,PCR扩增后的产物往往需要克隆到载体中，传统的PCR产物与载体的连接方法： PCR引物设计时引入载体上的酶切位点，PCR产物经双酶切后定向克隆到目的载体上。 这种方法的优点是定向连接克隆，筛选方便。缺点则是PCR产物的酶切和判断比较困难，另外酶切连接过程本身也相当的费时、费力。,现象：普通的Taq酶会自动给PCR产物的3末端添加一个A（3 -A） ，因此不能直接将PCR产物末端抹平后连接。,解决方法： Fill in the ends with Klenow（Klenow酶处理PCR产物将其补平，但平末端连接效率低） Remove extended bases with pfu DNA polymerase