第二章DNA及染色体的结构

1、染色体与DNA,染色体 DNA结构 DNA的变性、复性和COt曲线,原核生物染色体及基因组,基因组（genome）：是指细胞或生物体的全套遗传物 质，即生物体维持配子或配子体正常功能的全套染色体 所含的全部基因（DNA,比如人基因组的全长为大约3 X 109对碱基，编码 3-4万个 蛋白分子,细菌或噬菌体、病毒单个染色体中所含的全部基因（DNA,原核生物DNA特点（P22）： 一般只有一条染色体，且大都带有单拷贝基因，只有少数基因（如rRNA）以多拷贝形式存在； 整个染色体DNA几乎全部由功能基因和调控序列组成； 几乎每个基因序列都与它编码的蛋白质序列呈线性对应状态,染色体DNA成分占80，其

2、余为RNA和蛋白质,4.6 x 106bp的基因组DNA 与多种DNA结合蛋白组装成 E.coli的染色体,基因组DNA为双链环状，总长度为11001400m，1400 个基因都已定位,大肠杆菌的遗传物质,质粒DNA （plasmid DNA,细菌中另一类遗传物质,环状DNA，存在于染色 体之外，能自我复制,质粒也携带许多基因， 如：抗生素抗性基因,原核生物基因组特点（P30,结构简练 存在转录单元（多顺反子） 存在重叠基因,真核生物染色体及基因组,C值（C-value）：在真核生物中，每种生物的单倍体 基因组的DNA总量总是恒定的，称为C-值,C值是每种生物的一个特征，不同生物之间差别很大,

3、低等真核生物中与形态学复杂程度相关，但高等真核生物 中变化很大,C值反常现象（C-value paradox C值谬误）： 形态学的复杂程度与C值的不一致,阴影部分为一个门内C-值的范围,持家基因（housekeeping gene）：有些基因是在所有细胞类型中都表达的，即这些基因的功能为所有细胞所必需（或称组成型基因 constitutive gene,奢侈基因（luxury gene）：仅在某种特定类型的细胞中表 达的基因,大部分细胞生活周期里以染色质的形式存在（弥散状） M期染色体形式,染色质有两种型 a、常染色质：密度较低，能被表达 b、异染色质：密度较高，不被表达（着丝粒、端粒,组蛋

4、白的特点（P24）： 进化上的极端保守性 无组织特异性 肽链上AA分布的不对称性 组蛋白的修饰作用 富含Lys的组蛋白H5,染色体上非组蛋白类型： HMG蛋白 DNA结合蛋白 A24非组蛋白,组蛋白与DNA的结合,核小体,核小体盘绕及染色质示意图,从DNA到染色体的过程,Compaction ratio = 8000,真核生物染色体DNA组装不同层次的结构,DNA （2nm,核小体链（ 11nm，每个核小体200bp,纤丝（ 30nm，每圈6个核小体,突环（ 150nm，每个突环大约75000bp,玫瑰花结（ 300nm ，6个突环,螺旋圈（ 700nm，每圈30个玫瑰花,染色体（ 1400n

5、m， 每个染色体含10个玫瑰花200bp,真核基因组结构特点,基因组庞大 存在大量重复序列 非编码区超过90% 单顺反子 断裂基因 顺式作用元件 DNA多态性 端粒结构,重复序列1、高度重复序列,卫星DNA（Satellite DNA）： 将DNA切成数百个碱基对的片段进行超速离心时，由于富含AT的简单高度重复序列区段浮力密度较小，因而很容易和总体DNA分开，即常在主要DNA带的上面有一个次要的带相伴随,a、分布于着丝点, 端粒区（原位杂交）, 结构基因两侧,根据重复频率和大小又可分为卫星、小卫星和微卫星DNA,b、往往没有功能，不转录（着丝粒 纺锤体,人类和其他动物中：短的串联重复 5-50

6、 copies / genome 而且有共同的核心序列，但同一群体中重复次数变动很 大，个体间长度变化很大，可利用其得到DNA指纹图谱 （DNA finger printing,数目可变的串联重复或小卫星 ( Variable number tandem repeats . VNTR,2、中度重复序列,10-104 copies,非洲爪蟾的18S、5.8S、28S rRNA ，不转录区间隔,3、 不重复序列：一个或几个拷贝,4、反向重复序列（inverted repeatitive sequence or inverted repeats IR，又称回文序列）：指两段同样的核苷酸序列同时存在于

7、一个分子中，但具有相反的方向,较短的回文序列可能是作为一种信号 如：限制性内切核酸酶的识别位点 一些调控蛋白的识别位点（转录终止,C,反向重复序列间的间隔较短或无间隔,反向重复序列间的间隔较长,割裂基因（splitting gene） 不连续基因（discontinuous gene ） 断裂基因（interrupted gene,概念：编码某一RNA的基因中有些序列并不出现在成熟 的RNA序列中，成熟RNA的序列在基因中被其它的 序列隔开,断裂基因的发现,通过成熟mRNA（或cDNA）与编码基因的DNA杂交试 验而发现,断裂基因,前体mRNA,Introns 去除 Exons 连接,核酸的化

8、学组成,核酸,核苷酸,核苷,磷酸,碱基,戊糖,嘧啶Pyrimidines,嘌呤Purines,一、 含氮碱基、核苷、核苷酸,碱基 Nitrogenous bases,核苷（nucleotide,嘧啶的1位N原子、嘌呤的9位N原子,核糖是戊糖 RNA核糖核苷 DNA脱氧核糖核苷,1,9,核苷酸（nucleotide acid,核苷的磷酸酯 脱氧核糖核苷酸 核糖核苷酸,Deoxynucleotides,其中和、和之间是高能磷酸键,dNTP,Ribonucleotides,核糖核苷三磷酸缩写为NTP,核苷酸的结构和命名,腺嘌呤核苷酸（ AMP） Adenosine monophosphate,脱氧腺

9、嘌呤核苷酸（dAMP） Deoxyadenosine monophosphate,H,OH,二、DNA分子的一级结构 (DNA sequence,1、 多聚核苷酸链 主链是核糖和磷酸 侧链为碱基,由3,5磷酸二酯键连接,2、 链的方向：同一个磷酸基的3酯键到5酯键的方向 (53,5-UCAGGCUA-3 = UCAGGCUA 默认书写顺序53,DNA、RNA的一级结构,DNA一级结构,3、 DNA一级结构的特点,a、脱氧核糖是其显著特点 DNA稳定的根本原因,DNA在高pH值时磷酸酯键非常稳定 只是碱基存在构象的变化,酮式,烯醇式,酮式,烯醇式,b、RNA 在高pH时则稳定性很差,由于2OH导

10、致的水解,c、主链是亲水的，侧链（碱基）是疏水的 主链脱氧核糖的羟基能与水形成氢键，而磷酸基团在生理条件下离解为负离子。 这些特点保证了多核苷酸链可形成稳定的构象,4、 一级结构的概念 指DNA分子中的核苷酸排列顺序 不同生物借此贮存遗传信息 决定DNA的二级结构和高级结构,DNA的二级结构,提出 1953. Watson & Crick,右手 B- DNA Double helix Model,Phosphodiester Backbone,C-G,T-A,碱基互补,直径2nm,双螺旋模型（P34,螺距为3.4nm（任一条链 绕轴一周所升降的距离,每圈有10个核苷酸 （碱基,有大沟和小沟 配

11、对碱基并不充满双 螺旋空间，且碱基对 占据的空间不对称,两个碱基之间的垂直 距离是0.34nm，螺旋 转角是36度,Major Groove,Minor Groove,10 bp/turn,大、小沟的差异,大沟中碱基差异容易识别，往往是 蛋白质因子结合特异DNA序列的位点,小沟相对体现的信息较少,二、 影响双螺旋结构稳定性的因素,l 氢键 (Hydrogen bond 46 kc / mol,弱键, 可加热解链,氢键堆积, 有序排列(线性, 方向,l 磷酸酯键 (phosphoester bond 8090 kc / mol,强键, 需酶促解链,维持稳定性的因素,DNA双螺旋结构的呼吸作用：

12、DNA双螺旋结构中，配对碱基之间的氢键处于连续不断的断裂和再生的动态平衡中,l 碱基堆积力 (非特异性结合力,范德华力（Van de waals force） (1.7A/ 嘌呤环与嘧啶环 作用半径,0.34 nm/碱基对间距,疏水作用力 (Hydrophobic interaction,不溶于水的非极性分子在水中相互联合, 成串结合的趋势力，其中并无键的生成，即熵 值(Entrophy)S上升-热力学上的稳定态,成为碱基间的部分堆积力,磷酸骨架, 氨基, 酮基周围水分子间的有序排列,非极性分子间（嘌呤和嘧啶碱基）的相互成串结合 熵值 上升(S going up,l 磷酸基团间的静电斥力，将D

13、NA 双链分开,碱基内能增加(温度)，碱基排列有序状态的破坏，从而减弱 氢键结合力和碱基堆积力，破坏双螺旋,不稳定因素,l 0.2 mol / L Na+ 生理盐条件,消除DNA单链上磷酸基团间的静电斥力,三、双螺旋结构的多态性 （P36,DNA结构的多态性：几种不同的DNA双螺旋结构以及同 一种双螺旋结构内参数存在差异的现象,原因：多核苷酸链的骨架含有许多可转动的单键 磷酸二酯键的两个P-O键、糖苷键、戊糖环各个键,B-DNA来自相对湿度为92所得到的DNA钠盐纤维 A-DNA: RNA-DNA（转录） RNA-RNA RNA的核糖2-OH的存在，使之不能适应B构象，否则将与相邻的磷酸、核糖

14、和碱基上的若干原子靠的太近而造成不安定状态,Z-DNA调控基因转录的两个模式： 邻近调控 远距离调控,三种DNA双螺旋构象比较,A-DNA,Z-DNA,B-DNA,A B Z,外型 粗短 适中 细长,螺旋方向 右手 右手 左手,螺旋直径 2.55nm 2.37nm 1.84nm,碱基直升 0.23nm 0.34nm 0.38nm,碱基夹角 32.70 34.60 60.00,每圈碱基数 11 10 12,轴心与碱基对关系,2.46nm 3.32nm 4.56nm,碱基倾角 190 10 90,糖苷键构象 反式 反式 C、T反式，G顺式,大沟 很窄很深 很宽较深 平坦,小沟 很宽、浅 窄、深 较

15、窄很深,A,B,Z,A,B,Z,大沟宽,小沟窄,小沟窄,大沟变深,小沟宽深,大沟不存在,小沟窄而深,超螺旋（三级结构）和拓扑异构,螺旋和超螺旋电话线,螺旋,超螺旋,一、超螺旋（superhelix or supercoil,最早在SV40和多瘤病毒中发现,超螺旋是所有线性或环形DNA共有的重要特征,DNA的三级结构指双螺旋DNA分子通过扭曲和折叠所形成的特定构象，包括不同二级结构单元间的相互作用、单链和二级结构单元间的相互作用以及DNA的拓扑特征,DNA超螺旋结构的形成,1、 超螺旋结构的方向性,正超螺旋（positive supercoiled,导致左手超螺旋,负超螺旋（Negative S

16、upercoiled,导致右手超螺旋,超螺旋的形成总是要向着抵消初级螺旋改变的方向发展 所有生物的DNA几乎有5%为负超螺旋,DNA在水溶液中, 构型偏B型状态,DNA以10 bp/helix为最稳定构型,小于10bp/helix 向正超螺旋发展(紧缠态,大于10bp/helix 向负超螺旋发展(松缠态) 天然的DNA都是负超螺旋 但一些生命活动过程中存在正超螺旋（DNA 复制,B-DNA的变化情况,二、超螺旋状态的描述 1、可用数学公式描述 L = T + W,L 连接数（Linking number ） 双链DNA的交叉数， 不发生链断裂时，L为定值,T 盘绕数（Twisting numb

17、er ） 双链DNA的缠绕数，初级螺旋圈数,W 超螺旋数（Writhing number） 直观上为双螺旋在空间的转动数,W= 负值（negative superhelix） W = 正值 ( positive superhelix,DNA超螺旋的形成,超螺旋的拓扑学公式： L=T+W,超螺旋数(W)改变的结果之一是产生超螺旋 或是在B-DNA中保留一单链区域，但须能量的供给 B-DNA是力学上稳定的结构( 10 bp/ helix,2、体外可产生正超螺旋 溴化乙锭（Ethidium bromide EB） SV40的CCC分子,a、EB的插入只改变盘绕数T使其降低 但L值不变,WLT L值不

18、变 T值降低 W正值 产生正超螺旋,DNA超螺旋结构形成的意义,使DNA形成高度致密状态从而得以装入核中； 推动DNA结构的转化以满足功能上的需要。如负超螺旋分子所受张力会引起互补链分开导致局部变性，利于复制和转录,由上看出，超螺旋概念的要点： 初级螺旋处于松缠或紧缠状态 与松弛形式相比具有额外的自由能,三、拓扑异构酶,拓扑异构体：只在连接数上有差别的同种DNA分子称为 这种DNA的拓扑异构体,拓扑异构酶（topoisomerase ）：催化DNA由一种拓扑异 构体转变成另一种拓扑异构体的酶类,原核生物两类拓扑异构酶,除连环数（L）不同外其他性质均相同的DNA分子称为拓扑异构体（topoiso

19、merase）。 DNA拓扑异构酶通过改变DNA的L值而影响其拓扑结构。 拓扑异构酶I 通过使DNA的一条链发生断裂和再连接，能使超螺旋DNA转变成松弛型环状DNA，每催化一次可消除一个负超螺旋，即L增加，反应无需供给能量。 拓扑异构酶II则刚好相反，可使松弛型环状DNA转变成负超螺旋DNA，每催化一次，L 减少，可引入负超螺旋。拓扑异构酶II亦称旋转酶，它可以使DNA的两条链同时断裂和再连接，当它引入超螺旋时需要ATP提供能量。 细胞内两类拓扑异构酶的含量受严格的控制，使细胞内DNA保持在一定的超螺旋水平,改变超螺旋的方式,结合到一条链上形成复合物,切断一条链形成酶和DNA的复合体,一条链穿

20、越,重新连接,L=2,L=3,1、拓扑异构酶 (topoisomerase I,结果：连接数增加一个 (L+1,2、拓扑异构酶 Top II 旋转酶(gyrase) Top亚类之一 引入负超螺旋,作用于双链 涉及双链的 断裂和连接 即L,3、拓扑异构酶的生物学功能,b、防止细胞DNA的过度超螺旋 多种拓扑异构酶的作用严格控制体内负超螺旋 维持在5%水平 种拓扑异构酶的单向突变对细胞来说是致命的 因而一般两种拓扑异构酶的突变水平相当,a、恢复由一些细胞过程产生的超螺旋 如：复制叉前面正超螺旋的消除 转录酶前正超螺旋的消除，后面负超螺旋的产生,拓扑异构酶的反应本质：先切断DNA的磷酸二酯键，改变D

21、NA的连接数（L）后再连接之，兼具DNA内切酶和DNA连接酶的功能，但不能连接事先已经存在的断裂DNA。 拓扑异构酶的断裂反应和连接反应是相偶联的,DNA的变性、复性与Cot曲线,一、DNA分子的变性,1、变性（denaturation 或融解 melting）： DNA双螺旋区的氢键断裂，使双螺旋的两条链完全分开变成单链，这一链分离的过程叫做变性,条件：加热，高pH，有机溶剂（ 尿素、 酰胺 )，低盐浓度等,熔液黏度降低 沉降速度加大 浮力密度上升 此外吸收值升高（A260nm），即增色效应 指在DNA变性的过程中，它在260nm的吸收值先是缓慢 上升，达到某一温度时及骤然上升,天然DNA和

22、变性DNA的吸收值相差可达34,1.185,熔解曲线与Tm值,2、 常用的变性方法,热变性,碱变性,应用广泛，特别是用于变性动力学研究,缺点：高温引起磷酸二酯键的断裂，得到长短不一的单链,pH11.3时，全部氢键被淘汰,无热变性的缺点，为制备单链DNA的首选方法,保存单链DNA的条件 保持pH大于11.3 盐浓度低于0.01mol/L,D.S DNA,S.S DNA,Denaturation,Renaturation,复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞,二、DNA分子的复性 （anneal or renaturation,概念：变性DNA在适当条件下，两条彼此分开的链又可以 重新地合成双螺旋结构的过程（退火,复性DNA分子不一定是原有的一对互补链,1、 影响DNA复性过程的因素,S.S. DNA 的初始浓度 C0,DNA分子中，碱基排列情况（重复序列、单一序列,3-ATCTATGCTGTCAT-5,5-TAGATACGACAGTA-3,5-TAGATACGACAGTA-3,3-ATCTATGCTGTCAT-5,3-ATATATATATAT-5,5-TATATATATATA-3,3-ATATATATATAT-5,5-TATA