（完整版）剖析遗传病基因定位术诊治运用

1、关注我 实时更新 最新资料剖析遗传病基因定位术诊治运用摘要：荧光PCR定量技术(QuantitativePCR)是一种新兴 的基因定位技术。这项技术灵敏、简便、快速、不需使用放射性同位素，PCR完成后，通过测序仪 的自动识别即可对待测DNA进行定量分析。在遗传病，特别是一些以大片段缺失为主要突变类型 的遗传病诊断中，荧光PCR定量技术发挥了很重要 的作用。关键词：荧光PCR定量技术；基因定位技术；遗传病在早期 的遗传学分子诊断中，主要依赖于SouthernBlotting，寡核苷酸杂交等技术。自1985年Saiki等首次描述聚合酶链反应(polymerasechainreaction，PCR)

2、以来，PCR技术因为其灵敏特异，省时省力等诸多优点而受到了人们 的高度重视，已经应用于生物医 学和化学等基础研究 的各个领域，并且成为医 学临床和法医 学研究 的强有力分析工具之一1-3。然而，近几年来，研究者们不再满足于得知某一特异DNA序列 的存在与否，他们更着眼于对其进行精确 的核酸定量。尽管把PCR作为一种定量 的工具，在技术上还面临着一些挑战。荧光PCR基因定位技术是近十余年来兴起 的一种分子生物学技术，与其他定量方法相比，具有灵敏、简便、快速、不需使用放射性同位素 的特点，在基因表达、传染病和遗传病 的诊断等方面迅速得到了广泛应用。一、荧光PCR基因定位技术 的原理荧光PCR定量技

3、术 的主要原理为：在PCR前，通过化学方法在引物 的5端通过共价方式连接一个荧光分子。由于在进行PCR时，引物和待扩增模板端 的碱基不需要完全匹配，荧光PCR引物和普通PCR引物一样，能够对待测模板进行指数扩增。扩增完成后，根据PCR 的产量，将荧光PCR产物直接或按一定比例稀释后，和内标、载样缓冲液混合，在自动测序仪上进行电泳。在自动测序仪内激光 的激发下，PCR产物上 的荧光分子发出固定波长 的激发光，被仪器内 的光电管捕获。根据PCR产物从开始电泳到经过光电管 的时间，测序仪自动计算出相应产物 的实际碱基数。不同泳道之间电泳速度 的差别，通过各产物内混合 的内标校正。同时，测序仪也自动标

4、出相应产物 的荧光强度，该数值就是荧光PCR定量技术对模板进行定量与定位 的基础。与非定量PCR分析方法不同，荧光PCR 的操作程序有助于评估污染 的情况，即测出污染 的程度，即使阴性对照产生了正 的信号，只要这些信号比实验样品 的低得多，依据这样 的结果，至少可以推测出实验中所得出 的信号是真实 的。在一定程度上，荧光PCR消除了普通PCR过于敏感、假阳性率高 的缺点。荧光PCR常用于研究发病机制、估计病毒 的负荷量、监测临床治疗进展或用于诊断遗传缺陷等。通过对靶基因量 的检测，将其与疾病 的临床表现、临床分型以及各种标志酶 的值联系起来，为疾病 的诊断和药物治疗监测提供科学 的依据。目前，

5、该技术已广泛应用于多种遗传病 的诊断和产前筛查，如地中海贫血、儿童型脊肌萎缩症、杜氏/贝氏肌营养不良、胖骨肌萎缩症和各种染色体病等。二、荧光PCR基因定位技术在遗传病诊断中 的应用2.1在地中海贫血中 的诊断作用1988年，Chehab用两对引物同时扩增珠蛋白和珠蛋白基因，并在这两对引物上分别标记上罗丹明和荧光素。在紫外线 的照射下，罗丹明产生红色荧光而荧光素产生绿色荧光。在同一循环条件下PCR完成后，通过离心将扩增产物和游离引物分离，根据扩增后产物颜色直接判断基因 的缺失情况。如产物为桔红色，则说明和珠蛋白基因都得了扩增。如果产物为绿色，说明珠蛋白基因缺失，只有显绿色荧光 的珠蛋白基因得到了

6、扩增。2.2在DMD/BMD中 的应用DMD/BMD(杜氏/贝氏肌营养不良症)是最常见 的致死性神经肌肉遗传病。在男性中，其患病率约为1/3500，为x连锁隐性遗传，其中73%为缺失或重复突变，新生突变占所有患者 的30%。由于x染色体 的随机失活比例不同，约40% 的DMD携带者不能通过血清CPKH活性诊断。1992年，schwartz将荧光PCR应用于该病 的携带者诊断。他们采用荧光引物和测序仪分析位于肌营养不良基因内部 的4对CA重复序列。测序仪可以鉴别2个碱基对长度 的差异，能够为连锁分析提供更多 的信息。在以下情况时，连锁分析有时不足以对携带者进行判断：CA重复不能提供信息，家族成员

7、不全，新生突变或者嵌合体造成 的连锁分析失效，因此，他们还采用荧光PCR直接扩增肌营养不良基因外显子，并用测序仪定量分析产物，将结果和连锁分析一起作为判断携带者 的依据。通过以上方法，他们对43名可疑携带者进行了诊断。http:/wWw.gWyoO2.3在PGD 的应用植入前诊断(PGD)只能获得非常有限 的模版，而荧光PCR比溴乙锭染色要敏感1000倍，因此，荧光PCR在植入前诊断中 的应用已经有较多 的探索。等位基因失扩增(ADO)和污染是植入前诊断所面临 的两个主要问题，因此PGD需要检测致病基因和连锁分析进行联合判断。但是限于取材，PGD只能提供一次PCR 的模版。荧光PCR由于高灵敏

8、度和分辨率，适合对少量模版进行多重PCR扩增，在一个体系中同时完成对疾病基因 的检测和连锁分析。Joycec采用荧光多重PCR对6种遗传病：强直性肌营养不良(DM)、囊性纤维(CF)、脆性X综合征、神经纤维化2型和颅面成骨不全症进行了植入前诊断。在进行PCR 的过程中都同时扩增了一个多态位点，以确定被扩增细胞 的来源以及排除污染。对于显性遗传病，多态位点还能够减少ADO可能带来 的误诊。在他们进行 的研究中，对14次妊娠进行 的植入前诊断都得到明确结论，其中13例进行了胚胎移植，另有1例没有检测到正常胚胎。总之，PCR技术在定量与定位领域中 的应用已经逐渐由实验室中 的探索发展成为理解复杂 的

9、生物本质 的一项关键技术。毫无疑问，在不久 的将来，荧光定量PCR技术将以其精确 的定量，简单迅速 的操作，合理 的成本，在分子生物学、实验医 学，特别是临床医 学领域中得到更加广泛 的应用。参考文献1J.萨姆布鲁克，D.W拉塞尔.分子克隆实验指南M.3版.北京：科学出版社，2002：488.2彭志文，朱子平.PCR检测乙肝DNA 的注意事项J.中国医 药导报，2006，3（24）：147.3鲁军.荧光定量PCR检测乙肝病毒DNA 的临床意义J.中国医 药导报，2008，5（33）：78.4刘炜，马俊.FQ-PCR检测沙眼衣原体及解脲支原体J.中国现代医 生，2008，46（6）：139-14

10、0.5罗燕春，李勇，郑惠兰，等.荧光定量PCR检测淋球菌、沙眼衣原体结果探讨J.江西医 学检验，2005，23(6)：615-616.6于晓芳，许晏，刘漪，等.PCR-BHEL技术对血清中HCVRNA 的检测J.临床和实验医 学杂志，2008，7（9）：40.7张正分子生物学技术在检验医 学中 的应用J.中华检验医 学杂志，2003，26：735-7368SangierVeberP.DetectionofheterozygousSMN1deletionsinSMAfamiliesusingasimplefluoreseentmuitiplexPCRmethodJ.MedGenet，2001，38(4)：240-243.9Joyeec.Pre