一种基于HIV-1 TAT蛋白质转导结构域细胞内转导系统的成功改建

1、一种基于HIV-1 TAT蛋白质转导结构域细胞内转导系统的成功改建 作者：郭爱华；刘志锋；孙学刚；李海玉；邓鹏；姜勇(南方医科大学病理生理学教研室/广东省功能蛋白质组学重点实验室，广东 广州 )摘要：目的探索本室构建的pET14b-His-TAT-Flag重组载体表达的融合蛋白在细胞中转导效率低的原因，建立高效的细胞内转导系统。方法通过PCR方法去除原有载体中的Flag序列，在改建正确的pET14b-His-TAT重组载体基础上插入EGFP编码序列，将经酶切、DNA测序鉴定正确的pET14b-His-TAT-EGFP质粒转化E. coli BL21(DE3)，经IPTG诱导表达、SDS-PaG

2、E鉴定正确，再经蛋白透析、过滤处理。将His-TAT-EGFP融合蛋白加入ECV304细胞中，用荧光显微镜观察。结果重组质粒pET14b-His-TAT融合表达载体和pET14b-His-TAT-EGFP重组载体经酶切、DNA测序鉴定证实构建成功。表达纯化出了高纯度His-TAT-EGFP融合蛋白并具有较高细胞内转导活性。结论 成功改建pET14b-His-TAT-Flag重组载体，正确构建pET14b-His-TAT-EGFP载体，His-TAT-EGFP融合蛋白高效表达，并具有明确的细胞内转导活性。关键词：HIV-1反式激活因子；蛋白质转导结构域；融合蛋白；细胞内转导中图分类号：Q291文

3、献标识码：A文章编号：1673-4254(2006)05-0545-04Reconstruction of an intracellular transduction system based on HIV-1 TAT protein transduction domainGUO Ai-hua； LIU Zhi-feng； SUN Xue-gang； LI Hai-yu； DENG Peng； JIANG YongDePartment of Pathophysiology/Key Laboratory of Functional Proteomics of Guangdong Province

4、, Southern Medical University, Guangzhou , ChinaAbstract: Objective To explore the reasons for the low intracellular transduction efficiency of a previously constructed His-TAT-Flag recombinant protein and establish a more efficient transduction system. Methods The Flag tag of pET14b-His- Tat-Flag v

5、ector was deleted with PCR mutant kit, and enhanced green fluorescent protein (EGFP) coding sequence was inserted into the new pET14b-His-TAT recombinant vector. Enzyme digestion and DNA sequencing were performed for identification of pET14b-His-TAT-EGFP vector, which was then transformed into E. co

6、li BL21(DE3). After IPTG induction, the recombinant protein of His-TAT-EGFP was isolated and analyzed with SDS-PaGE. Purified His-TAT-EGFP recombinant protein was added to ECV304 cells and the fluorescence was observed to evaluate the transduction efficiency. Results pET14b-His-TAT vector and pET14b

7、-His-TAT- EGFP vector were successfully constructed, which was identified with enzyme digestion and DNA sequencing. His-TAT-EGFP fusion protein was expressed and purified successfully and showed cellular transduction activity. Conclusion The prokaryotic expression vector has been successfully constr

8、ucted by modifying pET14b-His-TAT-Flag, and the expressed and purified recombinant protein of His-TAT-EGFP possesses high efficiency of intracellular transduction activity.Key words: human immunodeficiency virus type-1 trans-activator; protein transduction domain; recombinant protein; intracellular

9、transduction收稿日期：2005-10-31基金项目：国家高技术研究发展(863)计划课题(2001AA)、广东省科技计划项目(A)、广东省自然科学基金重点项目(NO.13058)和广州市科技计划项目(2001-Z-035-01-1)Supported by High-Technology Research Development Program of China (863 Program)(2001AA), Sci-Tech Foundation Project of Guangdong Province(A), Natural Science Foundation of Guan

10、gdong Province(13058), and Science and Technology Development Program of Guangzhou MuniciPality(2001-Z-035-01-1)作者简介：郭爱华(1978-)，女，在读博士研究生通讯作者：姜勇，教授，电话：020-, E-mail： 1988年，Green和Frankel等发现，将人免疫缺陷病毒-1反式激活因子(HIV-1 TAT)与细胞共同培养时，TAT能迅速进入细胞，并且发现该蛋白质3772位氨基酸残基具有细胞内转导性质1，2。之后的研究发现，TAT蛋白中第3772

11、位氨基酸残基能够穿越细胞膜、转导进入多种类型细胞内3。因此，人们将类似HIV-1 TAT、能将外源蛋白质转导进入细胞的合成多肽或蛋白质中小的功能域称为蛋白质转导结构域(PTD)。研究证实HIV-1 TAT PTD具有广谱的蛋白转导作用4，这一发现开辟了蛋白质跨膜递呈抗原进行免疫治疗的新途径，而且，对于蛋白质和多肽药物转运系统的开发以及蛋白质功能的研究提供了一个有效的手段。Vivce等发现TAT分子中一个富含碱性氨基酸、具有较多正电荷的多肽片段与跨膜转导有关5。TAT蛋白PTD的核心序列由11个氨基酸组成，序列为YGRKKRRQRRR，其转导能力与全长TAT序列转导能力相当，其特点是转导速度快，

12、效率高。本研究室前期构建的pET14b-His-TAT-Flag重组载体表达的融合蛋白在细胞中转导效率很低，通过研究证实了TAT PTD中多聚阳离子序列在其介导细胞内转导过程中的重要作用，成功地建立了这种高效的细胞内转导系统，从而深化了我们对这一转导系统作用机制的理解。1材料和方法1.1材料由T7 RNA聚合酶调控的大肠杆菌高效表达质粒pET-14b-His-TAT-Flag由本室构建6；大肠杆菌DH5 菌株以及表达T7 RNA聚合酶的大肠杆菌BL21(DE3)由本室保存；质粒DNA提取纯化试剂盒购自日本Toyobo公司；DNA凝胶回收试剂盒购自U-gene公司；DNA定点突变试剂盒Mutan

13、t BEST Kit购自Takara公司；DNA重组所用限制性内切酶、T4连接酶均购自Toyobo公司；引物合成在北京三博远志生物技术有限公司进行；DNA序列测定在本室完成； Hela细胞由本室冻存。1.2方法1.2.1pET14b-His-TAT载体的构建 应用PCR点突变技术去除原pET14b-His-TAT-Flag重组载体中的Flag序列。设计一对高特异性引物，上游引物序列为：5-GGTACCCCCGGGCATATGCTCGAGGAT-3；下游引物序列为：5-TCTTCGTCGCTGTCTCCGCTT CTTCCT-3。反应条件为：95 预变性3 min，94 30 s，54 30 s

14、，72 1 min，扩增30个循环，再72 延伸5 min。1%琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物。根据产品说明书，将上述PCR反应中回收的目的DNA片段行钝化反应，苯酚/氯仿/异戊醇抽提后行乙醇沉淀，加入等量Ligation Solution I均匀混合后16 连接8 h。连接产物用经典CaCl2转化法转化感受态大肠杆菌DH5 ，以氨苄抗性LB琼脂培养板进行筛选，倒置于37 孵箱培养816 h，次日挑取若干单克隆菌落扩增后提取质粒(图1)，进行Kpn I和Xba I双酶切鉴定，并进行测序验证。1.2.2重组载体pET14b-His-TAT-EGFP的构建以pEGFP-C2质粒为摸板PCR扩增EGF

15、P的编码序列，上游引物为：5-AAGGTACCGTG AGCAAGGGCGA GGAGCT-3；下游引物为：5-TAACTCGAGCTAGAT CCGGTGGATCCC GG-3。反应条件为：95 预变性3 min，94 30 s，53 30 s，72 1 min，扩增30个循环，再72 延伸5 min。1%琼脂糖凝胶电泳回收EGFP产物目的片段。用Kpn I和Xho I对质粒载体pET14b-His-TAT和EGFP目的片段分别进行双酶切。1%琼脂糖凝胶切胶回收载体和目的片段酶切产物。于16 水浴8 h完成连接反应。连接产物用经典CaCl2转化法转化感受态大肠杆菌DH5 ，以氨苄抗性LB琼脂

16、培养板进行筛选，倒置于37 孵箱培养12 h，次日挑取若干单克隆菌落扩增后提取质粒(图1)，进行Kpn I和Xho I双酶切鉴定。对酶切鉴定初步正确的重组质粒进行DNA测序鉴定。 图1pET14b-His-TAT-EGFP载体构建流程图Fig.1Flow chart of the construction of pET14b-His-TAT-EGFP1.2.3His-TAT-EGFP细胞内转导方法的建立将测序正确的pET14b-His-TAT-EGFP重组质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单克隆接种于5 ml氨苄抗性LB液体培养基，37 ，225 r/min过夜扩增，次日转入200

17、 ml氨苄抗性LB液体培养基中扩增至OD值约0.30.4，加入IPTG(终浓度为1 mmol/L)，室温180 r/min诱导6 h，4 ，5 000 r/min离心10 min，收集细菌沉淀，加入6 ml裂解缓冲液(0.5 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L 咪唑，pH 8.0)，将细菌沉淀悬起，于冰上超声破菌，4 ，10 000 r/min离心15 min，收集可溶性蛋白上清于离心管中。将收集的蛋白上清过Ni2+-NTA亲和树脂柱，用裂解缓冲液洗柱1次，含250 mmol/L咪唑洗脱液500 l洗3次，依次收集纯化过程中各步骤流出液，样品行10%

18、SDS-PaGE电泳，考马斯亮蓝染色，鉴定目的蛋白的表达量与纯度。把纯化的His-TAT-EGFP融合蛋白在4 透析过夜，透析后的蛋白行过滤除菌。采用Bradford法行蛋白定量，80冻存备用。进行蛋白转导实验前1 d，在96孔板中以1104/孔铺入ECV304细胞。次日待细胞融合度达到60%80%，弃去96孔板内细胞原培养基，加入预先混合了His-TAT-EGFP融合蛋白(终浓度为500 nmol/L)的DMEM培养基，分别于15 min和3 h后，吸出培养基，用PBS洗3次，在荧光显微镜下进行观察。2结果2.1 重组载体pET14b-His-TAT的构建PCR产物进行1%琼脂糖电泳，可见一

19、条特异性条带，位于5 0006 000 bp之间(图2A)。pET14b- His-TAT PCR扩增片段经钝化自连反应后，重组质粒经Kpn I/Xba I双酶切，行2%琼脂糖凝胶电泳，可见切出一条100200 bp大小的片段，与作为对照的pET14b-His-TAT-Flag质粒的平行双酶切结果相比，切出的小片段略小，与预期相符(图2B)，最后经DNA测序证实载体构建成功。 图2pET14b-His-TAT载体的构建Fig.2Construction of pET14b-His-TAT vectorA: Amplification of pET14b-His-TAT fragment by

20、PCR; Lane 1: pET14b-His-TAT PCR fragment; M: 1 kb DNA marker; B: Identification of pET14b-His-TAT with Xba I and Kpn I; Lane 1: pET14b-His-TAT-Flag; Lane 2: pET14b-His-TAT; M: DL2 000 DNA marker.2.2重组载体pET14b-His-TAT-EGFP的构建以pEGFP-C2载体为模板， PCR扩增可见一条约800 bp的特异性条带，即为EGFP编码序列(图3A)。重组质粒行Kpn I和Xho I双酶切，酶

21、切产物用1%琼脂糖凝胶电泳分离，可见切出一条约800 bp特异性条带(图3B)，DNA测序证实载体构建成功。 图3pET14b-His-TAT-EGFP载体的构建Fig.3 Construction of pET14b-His-TAT-EGFP recombinant vectorA: Amplification of EGFP coding sequence by PCR; Lane 1: Amplified fragment of EGFP coding sequence; Lane M: 1 kb DNA marker; B: Identification of pET14b-His-T

22、AT-EGFP with Kpn I and Xho I; Lane 1: pET14b-His-TAT-EGFP recombinant vector; M: 100 bp DNA marker.2.3His-TAT-EGFP融合蛋白的原核表达与纯化pET14b-His-TAT-EGFP质粒转化BL21(DE3)菌，经IPTG诱导后的细菌裂解液在约33 kD处出现一条浓集的条带。用His亲和树脂层析后也在同样位置有一条高纯度的蛋白条带(图4)。 图4His-TAT-EGFP融合蛋白的表达与纯化Fig.4Expression and purification of His-TAT-EGFP f

23、usion proteinLane 1: Bacterial lysate without IPTG induction; Lane 2: Bacterial lysate with IPTG induction; Lane 3: Ultrasonic lysis supernatant after induction with IPTG; Lane 4: Wash fraction; Lane 5-7: Elute fractions; M: Protein marker2.4His-TAT-EGFP融合蛋白的细胞转导向ECV304细胞中加入终浓度为500 nmol/L His-TAT-EG

24、FP融合蛋白15 min后，撤去融合蛋白，用PBS漂洗3次后，置于荧光显微镜下观察，如图5B所示，可以看见视野中沿细胞轮廓分布的强度很高的绿色荧光，接着3 h后，如图5D所示，可见沿细胞轮廓分布的荧光模式演变为背景均一为暗绿色并上覆点状的荧光颗粒的分布模式。图5A和C图则分别显示与B和D相同视野下的可见光细胞形态。由此可见His-TAT-EGFP能够在15 min内快速进入ECV304细胞。 图5His-TAT-EGFP融合蛋白转导进入ECV304细胞荧光显微镜观察Fig.5 Observation of intracellular transduction of His-TAT-EGFP r

25、ecombinant protein into ECV304 cells by fluorescence microscopy (Original magnification:200)A: Administration of recombinant protein for 15 min (visible light); B: Administration of recombinant protein for 15 min (fluorescence); C: Administration of recombinant protein for 3 h (visible light); D: Ad

26、ministration of recombinant protein for 3 h (fluorescence)3讨论在目前使用的pTAT系列载体中，除了带有His tag、TAT PTD和HA tag外，尚无任何一个载体将TAT PTD序列与Flag tag同时毗邻偶连。随着对TAT PTD转导系统认识的深入，我们意识到：TAT PTD序列中富集着在该蛋白转导系统转导活性中被认为具有重要作用的精氨酸残基。精氨酸属于带正电荷的碱性氨基酸，TAT蛋白PTD的核心序列由11个氨基酸组成，其序列为YGRKKRRQRRR。已有报道TAT PTD中的9个氨基酸序列RKKRRQRRR就可实现将相对分子

27、质量在10120 kD范围内的外源性物质转运到多种不同组织和细胞内，是目前为止所发现的TAT PTD最短的序列，其转导能力并不比全长TAT序列转导能力差。所以TAT PTD蛋白转导系统中多聚阳离子所带的正电荷是关乎其转导活性有无或高低的重要因素。认识到这一点，我们认为找到了可能导致pET14b- His-TAT-Flag载体所表达的融合蛋白在细胞内转导效率低的症结所在。因为在这个融合载体中，组成TAT PTD的11个氨基酸序列与Flag-tag序列毗邻，而插入的Flag-tag的序列为DYKDDDDK (Asp-Tyr- Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)，其中富含5个带负电荷的

28、天冬氨酸。由于TAT PTD序列和Flag-tag序列位置相毗邻，推测在蛋白表达过程中，发生自身电荷作用互相中和，使TAT PTD丧失与细胞膜之间静电吸引作用，从而大大降低其蛋白转导活性。改建后载体所表达的融合蛋白能够以进入细胞的终浓度(500 nmol/L)加入细胞培养基15 min后，即可被细胞吸收，与文献报道相符7。本部分研究中对His-TAT-EGFP融合蛋白采用天然条件纯化，首先基于操作上的简便考虑，为了避免一旦进行变性条件下纯化随之而来的必须在不同尿素浓度梯度下降的透析以及在此过程中产生大量蛋白的沉淀所造成的蛋白丢失。事实证明，在天然条件下得到的His-TAT-EGFP融合蛋白具有

29、良好的细胞转导活性，至此，基于HIV-1 TAT PTD的细胞转导系统已成功建立。而作为近年来新兴的一门技术，HIV-1 TAT PTD介导的蛋白转导所具有的跨膜转运大分子的能力在基础医学研究和一些肿瘤性疾病、感染性疾病以及神经系统疾病的治疗研究中已崭露头角，其应用价值已受到广泛的关注。HIV-1 TAT PTD的应用，无论对于探索基础医学中的理论问题还是解决临床治疗中的实际问题，无疑提供了一个良好的工具8。参考文献：1Green M, Loewenstein PM. Autonomous functional domains of chemically synthesized human immunodeficiency virus Tat trans2 activator proteinJ. Cell, 1988, 55(6): 1179-88.2Frankel