微生物检验学之细菌的培养与分离技术

1、细菌的培养与分离技术一、基本条件二、细菌的接种与分离技术三、细菌培养的方法四、细菌的生长现象五、细菌 L 型的检查一、基本条件（一）细菌实验室中华人民共和国卫士行业标准中的微生物和生物医学实验室生物安全通过准则1. 细菌室必须安装严密的门窗，以防室内环境受到外界的污染。且室内禁用风扇，避免细菌的播散。的盛有消毒剂的水2. 细菌室必须安装供空气消毒的紫外线灯，置于操作台上面 1m 处，每天开始工作前照射 20min3. 室内应备有消毒剂，用于试验中发生菌液洒溅时的及时消毒处理。同时还应备有供工作人员浸手用盆、肥皂及自来水源等，应安装冲眼器4. 室内操作台须每日用消毒剂擦洗，地面至少一周用消毒剂擦

2、洗1 次。5. 对接收的标本、无菌器具、用过的物品等应明显分开并放在指定位置。同时要对用过的物品及时进 行灭菌处理6. 细菌室根据当地的气温特点，安装空调机，以适合细菌实验工作。同时室内应设置必要的消防设备。7. 细菌室必须安装生物安全柜，工作人员应在柜内处理标本及病原微生物。（二）无菌实验室 无菌实验室是细菌实验室内用于无菌操作的小室，其内部装饰、消毒条件要求更严格。1. 无菌室应完全圭寸闭，人员出入应有两道门，其间应隔有缓冲区。2. 用前应以紫外线消毒 30min ，定期用乳酸或甲醛熏蒸，彻底消毒。3. 在无菌室中一般仅限于分装无菌的培养基及传染性强的细菌的接种，不进行有菌标本的分离及其他

3、操作。4. 无菌室内应仅限操作人员进入，而且进入无菌室应着隔离衣和专用鞋，操作时戴口罩，随时保证室内的无菌状态。5. 无菌室应配备空调设备，保证不因室温而影响工作。（三）基本设备和器具 细菌实验室内必须具备的设备和器具有：用于细菌培养的温箱、 CQ 培养箱、厌氧培养设备；用于观察 细菌形态及标本直接镜检的显微镜；用于物品灭菌的高压蒸气灭菌器、干烤箱；用于储存培养基、诊断用 血清、抗生素及菌种 等的冰箱和冷藏柜；用于挑取标本、接种等的接种器具，包括接种环和接种针；制备 培养基时用的 pH 计；细菌检验操作时用 于接种器具灭菌的火焰灯或酒精灯；还有各种必用的平皿、试管、 吸管等玻璃器皿，以及离心机

4、、天平等。二、细菌的接种与分离技术（一）平板划线分离法在被检标本中，常混杂有多种细菌，平板划线分离法可使这多种细菌在培养基表面分散生长，各自形 成菌落，以便根据菌 落的形态及特征，挑选单个菌落进行纯培养。常用的平板划线分离法有以下两种：1. 连续划线分离法杂菌不多的标本。2. 分区划线分离法杂菌量较多的标本。（二）斜面接种法 该法主要用于单个菌落的纯培养、保存菌种或观察细菌的某些特性。（三）液体接种法多用于一些液体生化试验管的接种。（四）穿刺接种法此法主要用于半固体培养基、明胶及双糖管的接种。（五）倾注平板法测定牛乳、饮水和尿液等标本细菌数时常用此方法。（六）涂布接种法常用于纸片法药物敏感性测

5、定，也可用于被检标本中的细菌计数。三、细菌培养的方法根据临床初步诊断及待检细菌的种类，可选用不同环境条件进行培养。常用的有需氧培养法、二氧化碳培养法和厌氧培养法。为了提高检验的正确率，同一标本常同时采用两种或三种不同的培养法。（一）需氧培养法本法是临床细菌室最常用的培养方法，适于一般需氧和兼性厌氧菌的培养。将已接种好的平板、斜面和液体培养基等，置于35C温箱中孵育18?24h,般细菌可于培养基上生长，但有些难以生长的细菌需培养更长的时间才能生长。另外，有的细菌最适生长温度是28? 30 C,如鼠疫耶尔森菌，有的细菌甚至在4 C也能生长，如李斯特菌。（二）二氧化碳培养法有些细菌初次分离培养时须置

6、5%? 10%CO环境才能生长良好，如脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、牛布鲁菌等。常以下列方法供给 CQ。1. 二氧化碳培养箱2. 烛缸法3. 化学法四、细菌的生长现象（一）分离培养基上菌落的生长现象1. 观察菌落了解菌落的各种特征，以便确定对该菌如何进一步鉴别。菌落的各种特征包括大小、形状、突起、边缘、颜色、表面、透明度和黏度等。2. 血琼脂上的溶血a溶血：菌落周围血培养基变为绿色环状；红细胞外形完整无缺。B溶血：红细胞的溶解在菌落周围形成一个完全清晰透明的环。丫溶血：菌落周围的培养基没有变化；红细胞没有溶解或无缺损。双环：在菌落周围完全溶解的晕圈外有一个部分溶血的第二圆圈。半固体培养基用于观察细

7、菌的动力，有动力的细菌除了在穿刺接种的穿刺线上生长外，在穿刺线的两侧均可见有混浊或细菌生长的小菌落。五、细菌L型的检查细菌L型是细胞壁缺陷从而生物学特性发生改变的一种细菌，是细菌在不利环境下种系保存的一种形式。表现为形态多形性、染色不确定性、可滤过性、渗透压敏感性，生化反应减弱特性以及对份内酞胺类和其他作用细胞壁抗生素的抵抗性。 细菌L型检查对感染病原的确定及抗生素合理选择有重要意义，多采用培养观察的方法。培养基多以心脑浸液及牛肉浸液为基础，加入蛋白陈、氯化钠，以1%的琼脂浓度制备固体培养基。培养出的L型细菌菌落表现：常有油煎蛋样菌落（典型L型菌落）、颗粒型菌落（G型）和丝状菌落（F型）三种类

8、型。1. 标本采集应尽量采集无杂菌污染的组织或体液标本。胸腔积液、腹水及尿液标本，应加20%蔗糖无菌溶液，以保持高渗；血液标本应接种高渗肉汤增菌培养。如增菌肉汤出现轻度混浊或沉淀，再分离接种于L型选择平板或血平板。2. 培养方法（1） L型检查程序：将标本接种到高渗肉汤增菌培养1? 7d,然后转种L型平板和血平板37 C培养2? 7d。L型菌在L型琼脂平板上典型菌落为“荷包蛋”样，但从患者标本中新分离的 L型菌落常不典型，多呈【例题】临床细菌室最常用的培养方法是A. 需氧培养法B. 微需氧培养法C. 二氧化碳培养法D. 厌氧培养法E. 组织培养法正确答案 A答案解析需氧培养法是临床细菌室最常用

9、的培养方法，适于一般需氧和兼性厌氧菌的培养。【例题】肺炎患者，咳大量黄痰，作培养应A. 在血平板和麦康凯平板上连续划线法B. 在液体培养基增菌C. 接种斜面D. 在血平板和麦康凯平板上分区划线法E. 倾注平板法正确答案D答案解析杂菌较多的标本应用分区划线法分离出单个菌落。【例题】某尿路感染患者尿中分离出 L型菌，应用A.青霉素B.头孢唑林C.头孢曲松D.亚胺培南E.环丙沙星正确答案 E答案解析L型菌是细胞壁缺陷的细菌，故不能用作用于细胞壁的抗生素。【例题】倾注平板法A. 主要用于单个菌落的纯培养B. 多用于生化试验管的接种C. 主要用于半固体培养基的接种D. 主要用于液体标本中细菌计数E. 主

10、要用于含杂菌标本的分离培养正确答案 D答案解析倾注平板法常用于测定牛乳、饮水和尿液等标本细菌数。液体接种法多用于一些液体生化试验管的接种。穿刺接种法主要用于半固体培养基、明胶及双糖管的接种。平板划线分离法适用于混杂有多种细菌的标本，平板划线分离的目的是使标本中混合的多种细菌 在培养基表面分散生长，形成各自菌落。谢谢大家！3. 气味 通过某些细菌在平皿培养基上代谢活动产生的气味，结合液体培养基中的性状，有助于细菌的 鉴定。2. 血液培养的检查和传代培养培养瓶置 35C 6? 18h 后，用肉眼观察其生长现象，如：溶血、产生气体或混浊度等。 应每天肉眼检查细菌生长情况，若为生长阳性应做进一步的分离

11、鉴定和药敏； 若为生长阴性，应孵至第 7 天弃去。有些细菌如奈瑟菌属和嗜血杆菌属的菌株，心杆菌属、放线杆菌属的细菌都需要较长时间培养。血培养孵育 24h 后，肉眼观察阴性的血培养瓶，一般不需做常规显微镜检查，因培养物中有103 * 5 菌落形 成单位 CFU/ml ，才能通过革兰染色检出细菌。（三）细菌在半固体培养基中的生长现象 颗粒型菌落，涂片染色为多形性。必要时需经传代返祖后进一步鉴定菌种。（ 2） 检验报告1）血平板无菌生长， L 型平板有菌落生长，可报告检出细菌L 型。2）血平板中菌落细小，不易刮下。涂片检查细菌呈多形性，细胞壁缺损，L 型平板中有 L 型菌落，报 告检出 L 型。3）血平板及 L 型平板均有菌落生长。 涂片有原菌及 L 型两种形态特征，可报告细菌型及 L 型同时存在， 并分别作药敏 试验以供临床用药参考。【例题】在半固体培养基的穿刺线生长呈模糊或根须状，并使培养基变混浊的细菌的特点是A. 动力试验阴性B. 生长旺盛C. 无鞭毛D. 动力试验阳性E. 有杂菌存在正确答案 D答案解析半固体培养基用于观察细菌的动力，有动力的细菌除了在穿刺接种的穿