食品中志贺氏菌检验

1、志贺氏菌检验,一、实验目的,了解食品安全与志贺氏菌检验关系,1,了解志贺氏菌生理形态化学性质,2,掌握志贺氏菌检验方法和结果判断,3,检验食品中是否有志贺氏菌,4,二.实验原理,需氧或兼性厌氧。营养要求不高，能在普通培养基上生长，最适温度为37，最适pH为6.4-7.8。37培养18-24小时后菌落呈圆形、微凸、光滑湿润、无色、半透明、边缘整齐，直径约2nm，能分解葡萄糖，产酸不产气。不发酵乳糖，靛基质产生不定，甲基红阳性，VP试验阴性，不分解尿素，不产生H2S。根据生化反应可进行初步分类,三、实验的试剂和仪器,仪器与设备,试剂和仪器,培养基与试剂,仪器与设备,规格名称数量用途 1、500ml

2、广口瓶1个稀释样品 2、500ml三角瓶1个制增菌液 3、250ml三角瓶4个制培养基 4、18180mm试管制三糖铁培养基 5、13100mm试管 制蛋白胨水等 6、1ml移液管 7、10ml移液管 8、直径为90mm平皿 5副 制SS、EMB平板 9、250ml量筒1个 10、玻璃棒 11.、恒水浴箱 1个 12、显微镜 1台 镜检,培养基与试剂,GN增菌液225ml/瓶1瓶500ml三角瓶 EMB培养基100ml/瓶1瓶250ml三角瓶 SS琼脂 100ml/瓶 1瓶250ml三角瓶 三糖铁斜面 6ml/支 6支 15150mm试管 葡萄糖半固体培养费基 4ml/支 5支 13100mm

3、试管 蛋白胨水2ml/支5支 13100mm试管 5%乳糖发酵管 3ml/支5支 13100mm试管 甘露醇发酵管 3ml/支5支13100mm试管 棉子糖发酵管 3ml/支 5支 13100mm试管 甘油发酵管3ml/支 5支13100mm试管,四、实验步骤,验,步,骤,实,流程图,操作步骤,流程图,采样 样品处理 选择性增菌 选择性平板划分 生化实验 镜检 结果报告,实验前的准备,对烧杯、玻璃棒、移液管、试管、培养皿、锥形瓶的清洗 注意：洗涤后的仪器应达到玻璃壁能被水均匀湿润而无条纹和水珠 对试管、玻璃棒、移液管、锥形瓶、烧杯、培养皿进行包扎：要将报纸裁成5-10公分，成30卷起，结尾处向

4、上折叠即,包扎灭菌,培养基的制备,1.CN 增菌液 成分:胰蛋白胨20g 柠檬酸钠5g 磷酸二氢钾1.5g 葡萄糖1g 去氧胆碱酸钠0.5g 氯化钠5g 甘露醇2g 磷酸氢二钾4g 蒸馏水1000ml ph7.0 制法：按上述成分配好，加热溶解，校正PH。分装每瓶225ml ， 115 C高温灭菌15min 2、HE琼脂 成分：蛋白胨12g 水杨素2g 蒸馏水1000ml 乙液20ml 牛肉膏3g 胆盐20g 0.4% 溴麝香草芬兰钠溶液16ml 乳糖12g 氯化钠5g 蔗糖12g 琼脂20g 甲液20ml HP7.5 制法：将蛋白胨、乳糖、水杨素、氯化钠、蔗糖、牛肉膏、胆盐等溶解于400ml

5、蒸馏水中作为基础液；加琼脂与600ml蒸馏水中，加热溶解。加入甲液乙液与基础液中，校正HP,再加指示剂。并与琼脂液合并，冷却，倾注平板,培养基的制备,3、SS琼脂液的配制 成分：牛肉膏0.6g 琼脂2.04g 三号胆盐0.42g 蒸馏水120ml，月示胨0.6g 制法：将牛肉膏、月示胨和胆盐溶解于400ml蒸馏水中，将琼脂加入600ml蒸 馏水中，煮沸使其溶解，再将两液混合121高压灭菌15min,保存备用。 4、麦慷慨琼脂液的配制 成分：蛋白胨2.04g 脙胨0.36g 猪胆盐(或牛、羊胆盐)5g 氯化钠0.6g 琼脂2.04g 蒸馏水120mL 乳糖1.2g 0.01%结晶紫水溶液1.2m

6、L 0.5%中性红水溶液0.6mL 制法： 将蛋白胨、胨、胆盐和氯化钠溶解于400mL蒸馏水中，校正pH7.2， 将琼脂加入于600ML蒸馏水中， 加热溶解。将两液合并，分装于121高压灭菌15min备用。 临用时加热溶化琼脂，趁热加入乳糖，冷至5055时，加入结晶紫和中性红水溶液，摇匀后倾注平板,培养基的制备,5、伊红美蓝琼脂（EMB） 成分：蛋白胨 10g 2%伊红溶液20ml 乳糖10g 0.65%美兰溶液10ml 磷酸二氢钾28g 蒸馏水1000ml 琼脂17g PH7.1 制法：将蛋白胨、磷酸盐、琼脂溶解于蒸馏水中，校正ph，分装于烧杯内，121c高压灭菌15min备用。临用时加入乳

7、糖并加热溶解琼脂，冷却，加入伊红和美蓝溶液，摇匀。倾注平板。 6、三糖铁琼脂的配制 成分：蛋白胨4.8g 牛肉膏0.6g 乳糖1.2g 蔗糖1.2g 葡萄糖0.12g 氯化钠0.6g 硫酸亚铁胺0.024g 硫代硫酸钠0.024g 琼脂0.72g 酚红0.003g 蒸馏水120mL pH7.4 制法：将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH。加入琼脂，加热煮沸，以溶化琼脂。加入0.2%酚红水溶液12.5mL，摇匀。分装试管，装量宜多些，以便得到较高的底层。121高压灭菌15min。放置高层斜面备用,培养基的制备,7、生理盐水的配制 成分Nacl0.9g,蒸馏水100ml 制法一般每种

8、检样配制250ml生理盐水。称取2.2gNacl，加入250ml蒸馏水溶液；分装于2支大试管中，每支9ml，再量取225ml装入500ml广口瓶中，并加入适量的玻璃珠；剩余的装人另1支试管中，包扎后于121度高压灭菌15min 8、氯化钠结晶紫增菌液的配制 成分：蛋白胨2.4g 氯化钠4.8g 0.01%结晶紫溶液0.6mL 蒸馏水120mL pH9.0 制法：胨晶晶紫外，其他按上述成分配好，加热溶解。约加30%氢氧化钾溶液4.5mL，校正pH。加热煮沸，过滤。再加入结晶紫溶液，混合后分装试管。121高压灭菌15min,操作步骤,1.灭菌 干热灭菌：剪刀及棉绳等干热灭菌 湿热灭菌：均质袋、纱布

9、、各种培养基、生理盐水、增菌液 2.采样 从食堂中取一个鸡蛋 3.样品处理 将鸡蛋打碎放入无菌碗里，然后用杀菌的玻璃棒搅拌，在放入到均质袋中用均质器打匀 4. 增菌 称取检样25g，加入装有225mlGN增菌液的500ml的广口瓶内，于（361）培养6-8h,操作步骤,5.分离 取增菌液一环 ，划线接种于SS琼脂平板一个，伊红美蓝琼脂平板一个，于（361）培养18-24小时。志贺菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。 6.生化试验 挑取平板上的可疑菌落，接种三塘铁琼脂和半固体各一管，一般应多挑取几个以防遗漏，志贺菌属在三糖铁琼脂内的反应结果为底层产酸，不产气，斜面产碱，不产生硫化氢，无动力，在半固体管内，沿穿刺线生长。 7.镜检 从三塘铁琼脂和半固体各一管中挑取生长出来的菌落，进行革兰氏染色，然后放在显微镜下观察。 8.结果报告,五 注意事项,注意事项,3、增加鉴别培养基的数目，可以增加志贺菌的阳性检出率。用于分离的鉴别培养基一般不少于两个。中等选择性的，HE或SS琼脂平板一个；弱选择性的。麦康凯或EMB琼脂平板一个。WS琼脂可作为中等选择性培养基使用，