大肠杆菌感受态细胞的制备

1、大肠杆菌感受态细胞的制备、 重组DNA的转化、克隆筛选,1. 实验目的和要求 通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受体菌细胞的技术以及筛选转化体的技术。 了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义,2. 相关知识及原理 感受态细胞(Competent cells): 受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的细胞 。 （人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,转化（transformation）： 是将异源DNA分子导入受体细胞，使受体细胞获得新的遗传性状的一

2、种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。 进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株,转化的方法： 化学的方法(热击法)；使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞； 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞,转化方法的实验原理 热激法是利用冰冷的CaCl2处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的“感受态”，易于摄取外源DNA。转化效率为106 107转化子

3、/g DNA。 电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中含有尽量少的导电离子。转化效率为1091010 转化子/g DNA,3仪器、材料和试剂 无菌超净台，电热恒温水浴，分光光度计，离心机，移液器，微型离心管等； 菌株：E.coli jM109 质粒：pUC+DNA 片段的重组质粒 LB培养基； 含抗菌素的LB平板培养基（氨苄青霉素，终浓度100gmL ) 氨苄青霉素；母液200mg/ml 预冷CaCl2溶液（0.1molL,4操作步骤 1）大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法,1）从新活化的E.coli E.coli jM10

4、9菌平板上挑取一单菌落，接种于35ml LB液体培养中，37振荡培养12h左右,将该菌悬液以1:1001:50转接于100ml LB液体培养基中，37振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔2030min测一次OD600nm，至OD600nm0.5时停止培养,2）每组取培养液1-4ml转入离心管中，在冰上冷却5min(可省略）,5000rmin离心2min （3）倒净上清培养液，用1ml冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴30min ； （4） 5000rmin离心2min； （5）弃去上清液，加入400l冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心悬浮细胞。 5000rmi

5、n离心2min,6）弃去上清液，加入200l冰冷的0.1mo1L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液； （7）制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，也可加入占总体积15左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-70条件下，可保存半年至一年,2）细胞转化 分别取3个200l感受态细胞悬液(如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作)， 第一组，转化实验组 加入5 l重组质粒DNA + 200l感受态细胞 第二组，插入DNA片段对照组， 插入DNA片段+200l感受态细胞悬液； 第三组，质粒DNA对照组 1ng 质粒DNA十200l感受态细

6、胞悬液,2) 将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置30min，于42水浴中保温1.5min，然后迅速冰上冷却2min (3) 立即向上述管中分别加入0.6ml LB液体培养基（不需在冰上操作），使总体积到0.8ml，该溶液称为转化反应原液，摇匀后于37振荡培养约45min ，使受体菌恢复正常生长状态,3) 平板培养（有时需要稀释） 取各样品培养液0.1ml，分别接种于含抗菌素LB平板培养基上，涂匀（如果用玻璃棒涂抹，酒精灯烧过后稍微凉一下再用，不要过烫,2) 菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于37恒温培养箱内培养过夜(12-16小时)，待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养 用 CaCl2法制备

7、的感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒 DNA产生5106-2107个转化菌落。在实际工作中，每微克有105以上的转化菌落足以满足一般的克隆实验,为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素： 1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于的培养菌，最好从70或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液,2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比 加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。 1ng的cccDNA即可使50l 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5,3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处,4. 防止杂菌和杂DNA的污染： 整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦,重组质粒克隆的鉴定 鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有 -互补 小规模制备质粒DNA进行酶切分析 插入失活 PCR 杂交筛选的方法 最常用的方法是小规