通冠胶囊对骨髓单个核细胞向损伤血管内膜迁移分化的影响

1、通冠胶囊对骨髓单个核细胞向损伤血管内膜迁移分化的影响,研究背景,骨髓干细胞是一类具有自我更新和多项分化潜能的细胞。 如何诱导骨髓干细胞的分化、迁移、归巢仍是当前研究的热点。 已有研究证明多种细胞因子、药物等可以促进和动员骨髓源内皮祖细胞分化，进而修复损伤血管内膜,研究目的,探讨益气活血类中成药通冠胶囊对骨髓单个核细胞向损伤血管内膜迁移分化的影响。 通冠胶囊组成：丹参、黄芪、水蛭等。广东省中医院制剂，0.5g/粒,处方来源,通冠胶囊根据方剂配伍规律结合中药药理研究拟方而成，得到邓铁涛教授的首肯，认为组方严谨，药简力宏，君臣佐使，配伍得当,研究方法,Wistar大鼠30只（180-220g），10

2、只为干细胞供体，余20只纳入实验，治疗组、对照组各10只，1周后，予颈动脉内膜损伤。 颈动脉损伤后24小时内经尾静脉注射经PKH26标记的骨髓单个核细胞5106个/只。治疗组通冠胶囊（600mg/kg/d）灌胃，对照组等量的生理盐水灌胃，4周,PKH26的特性,PKH26是一种亲脂性的荧光染料，它可以与细胞膜不可逆地结合，对细胞进行荧光标记。 在551nm激发光的作用下可发出波长为567nm的红色荧光。在适当的标记后，不影响细胞的活力。 随着细胞的分裂，标记物等份地分配到两个子细胞。用PKH26标记红细胞在体内半衰期可达100d。 根据这些性质PKH26被广泛用于细胞的标记、示踪,30只Wis

3、tar大鼠，10只为供体，20只为受体 普通饮食一周后，20只受体大鼠行颈动脉损伤,取供体大鼠骨髓制成单个核细胞悬液并PKH26标记，0.2ml/只由受体大鼠尾静脉注入,通冠胶囊组,生理盐水组,4周后处死大鼠，提取标本，冰冻切片,免疫荧光组织学检测,ELISA检测VEGF、SDF-1,收集数据，录入数据库，分析数据,技术路线,检测血管内膜/膜厚度,随机,颈动脉内膜损伤模型,大鼠用10%水合氯醛麻醉后，颈部正中切口，暴露右侧颈总动脉及其分叉处，从分叉处向近心端游离颈总动脉约2 cm，用动脉夹夹闭颈总动脉近心端和颈内动脉。然后颈外动脉远心端挂线结扎，用眼科剪在结扎处附近剪一个“V”形口，从右颈外动

4、脉向颈总动脉插入1.5F的球囊导管约1.5 cm，然后向导管内注入20ml空气，拉脱3次即可，结扎颈外动脉远心端，松开动脉夹后逐层缝合肌肉及皮肤,颈动脉三叉,导丝进入,球囊扩张拉伤,损伤图解,V Lindner. Mouse model of arterial injury.Circulation,大鼠骨髓单个核细胞的提取方法,无菌条件下取大鼠的股骨，纱布剥离骨头表面的肌肉及组织，骨骺端钻孔。 5ml注射器抽取5ml的PBS液，由股骨的骨骺端冲出骨髓血，连冲3次，离心，弃上清，3ml的1640重悬。 将含有骨髓血的1640液，1：1平铺于大鼠淋巴细胞分离液上（天津津脉），水平离心，2000r/

5、min，15min。 吸取白膜层（第3层）于离心管内，加入4mlPBS液，1500r/min，5min，洗3遍,PKH26染骨髓单核细胞的方法,加入lm l Diluent C重悬细胞，轻轻吹打细胞。 染色之前即刻，在含有1mlDiluent离心管中配制410 mol/L（4l）的PKH26染料。 迅速均匀地将1ml的细胞液和含有1mlDiluent的染料液相混合，轻轻吹打、混匀。 25孵育25 min，不时吹打混匀。 加入等量的血清（2ml）终止反应， 放置1min。加入等量的完全培养液稀释。 1500r/min,5min. 弃上清。无血清培养液3ml重悬细胞,大鼠骨髓单个核细胞的提取,单核

6、细胞 100,PKH26染后的单核细胞,单核细胞层（白膜层,实验结果1,血管内膜再内皮化的面积：颈动脉损伤后3天、1周、2周，1的Evans blue 2ml经尾静脉注射，生理盐水灌流5分钟后，取出损伤部位的颈总动脉长约1cm，血管纵向切开，平铺固定,损伤后3天,损伤后1周,损伤后3周,实验结果2,计算血管内膜中膜厚度：3周后将两组大鼠的损伤颈总动脉冰冻切片，行HE和弹力纤维染色，光镜下，图像分析，计算两组的内膜、中膜厚度和比值,通冠胶囊组,盐水组,颈动脉横切HE染色50,通冠胶囊组,盐水组,颈动脉弹力纤维染色50,通冠胶囊对球囊损伤后内膜增殖影响,对照组内膜50,治疗组内膜 50,治疗组内膜

7、面积和内膜/中层面积比值均低于对照组（P0.05）。提示通冠胶囊具有抑制球囊损伤后血管内膜增殖的作用,张敏州，等.通冠胶囊对兔球囊血管成形术后血管病理形态的影响，中国中医急症，2006,实验结果3,观察PKH26标记的骨髓干细胞在损伤动脉内膜处的表达：取颈总动脉冰冻切片，室温下避光1h，中性树胶封片，在荧光显微镜下观察，发红色荧光和绿色荧光的血管内膜,盐水组50,PKH26,FITC-VEGFR-2,通冠胶囊组50,实验结果4,药物干预后，ELISA法检测两组大鼠血清中基质细胞衍生因子-1（SDF-1）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）的浓度，探讨通冠胶囊动员内皮祖细胞的分子机制,VEGF浓度

8、（pg/ml,SDF-1浓度（pg/ml,2周、3周后通冠胶囊组VEGF和SDF-1浓度均较对照组有明显升高（P0.05,讨 论,骨髓干细胞与内皮祖细胞,生理作用：骨髓单个核细胞含有造血干细胞、骨髓间充质干细胞、内皮祖细胞等细胞成分，其均为单细胞组成，故称为骨髓单个核细胞,具有多向分化潜能。 损伤修复：EPCs具有高度分化和增殖潜能，在特定的生长条件下可分化为EC，在损伤血管修复中的作用至关重要，所以EPCs是内皮完整性得以维持的决定性因素。当EC受到损伤或发生凋亡时，EPCs作为内皮补片添补坏死细胞造成的空缺,长期和反复暴露于心血管危险因素最终耗尽内皮细胞内源性抗炎系统的保护效应,不但造成内

9、皮功能异常而且使内皮细胞失去完整性,造成细胞衰老脱离循环,反映内皮细胞或内皮细胞膜（内皮微粒）脱离,随着年龄增长和ROS持续发信号，临近内皮细胞对损伤内皮的修复能力有限使得维持血管完整性依赖于EPC参与,体育锻炼、雌激素 、PHA、他汀、 G-CSF SDF-1 VEGF PDGF、EPO、HGF、Ang-I、 SCF、FGF、PGF,凋亡体、细胞与细胞 接触、黏附分子,VEGF、SDF-1,EPC的动员、归巢和分化除受到各自独立的因素调控外，还可受到多种共同因素的调控。VEGF和SDF-1既可促进EPC动员，又可促使其归巢,对内皮祖细胞动员归巢分化作用的因素,I型PI3K（IA和IB），IA

10、 型PI3K（p110和p85），PI3K通过两种方式激活, 一种是与具有磷酸化酪氨酸残基的生长因子受体或连接蛋白相互作用, 引起二聚体构象改变而被激活; 另一种是通过Ras和p110直接结合导致PI3K的活化。PI3K激活产生第二信使PIP3, PIP3与Akt和PDK1结合, 促使Akt的活化。Akt还能通过PDK2而被激活。活化的Akt通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Bad、Caspase9、NF-B、GSK-3、FKHR 、p21Cip1和p27 Kip1等, 进而调节细胞的增殖、分化、凋亡以及迁移等,后期研究,EPCs的分离、培养,1010,EPCs染色与鉴定,通冠胶囊对EPCs

11、周期的影响,24h,48h,组别,Con,Simv,TGC,Wortmannin,5.420.56,7.010.65 a b,14.720.21a c,2.870.63,3.760.21,14.720.21a b,2.050.07,a 与con相比 P0.01,b 与 WT相比 P0.01,c TGC24h与 simv24h相比 P0.01,18.72.720.23,通冠胶囊对EPCs的迁移影响,通冠胶囊对EPCs的迁移影响,2010,通冠胶囊对EPCs的粘附作用,组别,con,Simv,TGC,Wortmannin,24h,48h,26.661.32,30.662.29a b,31.442.

12、69a b,25.111.96,20.662.44,31.223.86a b,30.771.64a b,19.771.56,a 与con相比 P0.01,b 与 WT相比 P0.01,正在进行实验,Western blotting检测Akt、VEGF、eNOS蛋白的表达，以探讨通冠胶囊动员骨髓内皮祖细胞修复损伤内皮的细胞信号传导通路,通冠胶囊的前期研究基础,张敏州，李松，邹旭，等.通冠胶囊对冠心病介入术后血脂含量和凝血功能的影响.广州中医药大学学报.2004.21(2)：93-97. 张翔炜，张敏州，李松，等.通冠胶囊对冠心病介入术后凝血、纤溶系统的影响.中国中西医结合杂志.2004.24(12）：1065-1068. 林晓忠，程康林，邹旭，等.通冠胶囊对动脉内膜损伤后胶原表达及血管平滑肌细胞增殖的影响.新中医。2007.39（11）：101-103. 赵新军，张敏州.通冠胶囊对高脂大鼠血脂水平和血浆炎症因子的影响.中西医结合心脑血管病杂志. 2007.5（10）：951