细胞凋亡实验步骤及注意事项 细胞爬片制备详细过程 肿瘤细胞侵袭实验

1、细胞凋亡实验步骤及注意事项 一、实验目的 1、掌屋凋亡细胞的形态特征 2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的方法 二、实验原理 细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。 在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的

2、凋亡小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而不引起炎症反应。 在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳，可显示以180-200bp为基数的DNA ladder（梯状带纹）的特征。 相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期即丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释放出其中的内容物，引起炎症反应，坏死过程中细胞核DNA虽也降解，但由于存在各种长度不等的DNA片断

3、，不能形成梯状带纹，而呈弥散状。 一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。 三尖杉酯碱（HT）是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病，急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0.025g/ml范围内作用2小时，即可诱导HL-60细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。本实验用1g/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡，同时也有少数细胞发生坏死。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）对细胞进行双重染色，可以区别凋亡、坏死及正常细胞

4、。 细胞膜是一选择性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏中，使坏死RNA或DNA就进入细胞内部，它可嵌入到PI死时，质膜不完整，细胞着色，凋亡细胞和活细胞不着色。而一些活细胞染料由于为亲脂性物质，可跨膜进入活细胞，因而可进行活细胞染色。Hoechst33342是一种活性荧光染料且毒性较弱，它是双苯并咪唑的一种衍生物。与DNA特异结合（主要结合于A-T）碱基区），显示凋亡细胞和活细胞。凡是看到有凋亡小体的细胞都是凋亡细胞。 三、实验用品 1、试剂：三尖杉酯碱（HT），300g/ml，100mmol/L Tris-HCl（pH7.5），5mol/L EDTA缓冲液、碱性裂解液：0

5、.2mol/L NaOH, 1%SDS、醋酸钠：3mol/L KAc（pH4.8）；异丙醇；70%乙醇；溴酚蓝，蔗糖指示剂。TBE电泳缓冲液，1%琼脂糖，溴乙锭。PI母液：500g/ml；Ho33342母液：2mmol/L。 2、仪器设备：荧光显微镜，电泳仪，电泳槽，微量加样器（1ml，100l）0.5、1.5ml离心管，载玻片，盖玻片。 四、实验材料 人早幼粒白血病HL-60细胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培养基在37，5%CO2条件下培养。 五、方法步骤 1、三尖杉酯碱诱发HL-60细胞凋亡 （1）实验前约24小时，接种两瓶HL-60细胞，标记、，每瓶含约6ml培养液，置37，5

6、%CO2培养箱培养。 （2）实验前约2.5小时，当细胞密度达到70%，号瓶加入三尖杉酯碱200l，使终浓度为1g/ml，号瓶中加入同等量PBS（pH7.4）作对照。共同放入培养箱中继续培养2.5小时。 2、Ho33342和PI双重染色鉴别三种细胞 （1）染色：将瓶中的细胞摇匀取200l于1.5ml的离心管中，加入Ho33342母液2l，PI 20l，染色15分钟。 （2）滴片：取一载玻片用双面胶围成一小室，从离心管中各取以上染色后的细胞悬液10l，加入小室内盖上盖玻片，荧光镜下用紫外激发光，高倍镜下观察，区别三种细胞，并注意三者比例。 注1. 诱导培养HL-60细胞时间要准确； 意2. 荧光显

7、微镜下观察细胞时，由于荧光易碎灭，观察时要尽量快。 事项 细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细其胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己他 结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。 在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞

8、，因而不引起炎症反应。 在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳，可显示以180-200bp为基数的DNA ladder（梯状带纹）的特征。 相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期即丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释放出其中的内容物，引起炎症反应，坏死过程中细胞核DNA虽也降解，但由于存在各种长度不等的DNA片断，不能形成梯状带纹，而呈弥散状。 一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在

9、诱导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。 【爬片的准备】 1.爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片； 2.应用盖玻片，可根据自己的需要剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；裁剪时可用前护士输液用于打开玻璃安瓶的小沙轮，或者是口腔科的那种小沙轮，轻轻划一下后，稍用力一掰就分开了。 如果接种大皿的话，我一般不将盖玻片切开，直接清洁后放入培养皿中，到染色时再将之切开，这样既保证了细胞均一性，又可同时做几个指标的染色。 3.将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍（个人

10、认为主要目的是将酸冲洗干净就可以了，如果不干净的话，细胞帖壁不好），放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。 4.高压后取出放入烤箱中烤干，备用。烤干后可放入超净台中。 5.关于多聚赖氨酸，很多人都将玻片用此处理，以使细胞与玻片结合更牢。但我在做爬片时从来没用过多聚赖氨酸，细胞贴壁仍然很好，且在做后续的免疫细胞化学染色、TUNEL等凋亡检测、免疫荧光等也从未脱过片。 【细胞爬片】 1.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。 2.加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层

11、细胞贴片。整个过程注意无菌操作。 3.根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可 4.待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。 5.按照实验设计，作用一定时间后取玻片。取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，我一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。如果要做诸如24h，48h，72h等这样时间点的实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。末取出的可接着继续培养。 【细胞爬片的固定】 洗2遍，然后再做固定。当然，根据研究目的，PBS细胞爬片取出后，一般用PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡的TUNEL染色时就避免洗，因为凋亡的细

12、胞在洗的过程中有可能会脱落。 另外在保存细胞爬片的时候，我一般用培养皿或板，先在皿底放一层面巾纸，然后再放爬片，这样方便做实验时取片。然后盖上盖子，并在盖子上做标记，为避免混淆，可用透明胶带将盖子和皿连在一起。一般-20保存2-3个月的片子做免疫组化是没有问题的。 以下为常用的固定液 1. 冷丙酮 可用于一般的免疫组化染色。 将纯的丙酮预先放入冰箱-20后便为冷丙酮（放心，丙酮在此温度不会为固体的）细胞爬片取出后，PBS洗2遍，便可加入冷丙酮于-20（丙酮有很强的挥发性，注意将含有丙酮和爬片的器皿盖严，防止其挥发）固定10分钟。取出后，室温吹干，然后放入-20保存。 2. 多聚甲醛(常用4%)

13、：可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光以及TUNEL染色。 主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等 室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20保存 3. 95乙醇，可用于免疫组化。 优点：穿透性强、抗原性保存较好。 缺点：但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度 室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20保存 4. 甲醛(福尔马林)应用最广 优点：形态结构保存好，且穿透性强， 缺点： 甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影

14、响染色； 分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。 肿瘤细胞侵袭实验（Tumour Invasion Assay） 肿瘤细胞侵袭实验（Tumour InvasionAssay）可以：（1）研究各种细胞因子对恶性肿瘤细胞侵袭和转移的影响；（2）一些抑制血管生成的新药研究；（3）研究肿瘤细胞侵袭和转移机制。 实验方法 Matrigel 基质膜模型 ?Matrigel 是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成分，含有LN、IV型胶原、接触蛋白和肝素硫酸多糖，铺在无聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯滤膜上，能在DMEM培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基

15、质膜结构极为相似。 滤膜孔径一般为8um，而且膜孔都被Matrigel覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有Martrigel 的滤膜，这与体内情况较为相似。 铺有Martrigel的滤膜放在以Blind Well腔或MICS腔上下室之间，铺有Martrigel面朝向上室，在下室中加有趋化剂，如一定浓度的LN、FN或小鼠3T3条件培养液或人睾丸上皮成纤维细胞培养液，上室加入重悬的瘤细胞，具有侵袭能力的细胞在趋化剂诱导下开始穿膜运动。细胞穿膜所用的时间与Martrigel的用量有关，选择 25ugMartrigell铺膜，16小时后观察实验结果较为合适。穿过滤膜的

16、细胞多数粘附在滤膜下表面，可用棉签将上表方法面的细胞拭去，然后用乙醇固定滤膜，PE染色，在光镜下观察统计穿过原理 Martrigel的细胞数。另外用Transwell小室也可进行重建基质膜侵袭分析，这一方法是在 Transwell小室吊篮式上腔的滤膜上铺上30ugMartrigel，加入细胞72h后观察结果。值得注意的是，细胞在TransWll腔中培养 72小时后，有相当数量穿过滤膜的细胞不再粘附在滤膜下表面，而是脱落进人下腔溶液中因此统计穿过基质膜的细胞数目时应把这部分细胞考虑在内。肿瘤细胞穿过重建基质膜的能力与它的体内侵袭转移能力表现出较好的相关性，可以用重建基质膜模型初筛抗侵袭药物。 在

17、上述分析中，如果不在膜上铺Martrigel而直接将8um孔径滤膜安放在侵袭腔室上下腔室之间，细胞通过变形运动穿过滤膜，用这种模型对分析细胞运动能力和药物对细胞运动能力的影响。另外，在下室中加有LN或FN或在滤膜下表面铺上LN或FN，可分析药物对肿瘤细胞的趋化性或趋固性的影响。 实验Matrigel 基质胶 材料 试剂、DMEM结晶紫染料溶液醋酸低血清DMEM培养基FBS-DMEM培养基试剂IFN- 盒 仪器、24-transwell (Coster)离心管冰箱离心机移液枪枪头枪头盒 耗材 一、溶液配制实验步骤 1. DMEM （1）NE-A液（1 g/l，1 mg/ml） （2）母液0.1

18、ml（5 mg）+ ddHO up to 5 ml ；过滤消毒，-20保存。 22. NE-DMEM（-6 M） NE-A液（1 g/l，1 mg/ml） 20.5 l DMEM UP TO 100 ml 过滤消毒，4保存 3. NE+CGRP-DMEM（-6 M，100 ng） （1）NE-A液（1 g/l，1 mg/ml） 20.5 l （2）CGRP-储存液 50 l （3）DMEM UP TO 100 ml （4）过滤消毒，4保存 4. NE+IFN-DMEM（-6 M，50 ng） （1）NE-A液（1 g/l，1 mg/ml） 20.5 l （2）IFN-（25ng/l） 25 l （3）DMEM UP TO 100 ml （4）过滤消毒，4保存。 5. 低血清DMEM培养基（上室） 6. 20?S-DMEM培养基（下室） 7. Matrigel 基质胶 （1）10 mg/ml，5 ml，分装成0.5 ml/只10个EP管中。 （2）用时加入0.5 ml的DMEM。 （3）Matrivgel在冰上维持液态，室温时可迅速凝结成胶。 二 、 准备 1. 溶胶，4过夜。 2. 室温下基质胶易成凝胶，所以，步骤2和3种使用试管和枪头要在试验前-20C预冷。 三、 包被基底膜（冰上操作） 1. 用无血清的冷细胞培养基DMEM稀释Mat