ELISA原理方法及操作细节

1、ELISA,酶联免疫吸附试验,主讲人：刘,畅,研究生,导,师：马学恩,教,授,ELISA,酶联免疫吸附试验,Enzymes linked immunosorbent assay,简,介,1971,年，瑞典学者,Engvail,和,Perlmann,荷兰学者,Van Schuurs,分别报道将免疫技术发展为检测体液中,微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附,试验,ELISA,就是将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反,应相结合而建立的一种新技术,该技术应用非常广泛，几乎所有的可溶性抗原,抗,体系统均可用以检测,酶和抗体或抗原结合后，既不改变抗体与抗原,免疫学反应的特异性，也不影响酶本身的酶学,

2、活性，即在相应而合适的作用底物参与下，使,基质水解而呈色，或使供氢体由无色的还原型,变为有色的氧化型。这种有色产物可用肉眼,光学显微镜和电子显微镜观察，也可用分光光,度计加以测定。呈色反应显示了酶的存在，从,而证明发生了相应的免疫反应,所以，这是一种特异而敏感的技术，可以在细,胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位,或在微克，甚至纳米水平上对其进行定量,基,本,原,理,先将已知的抗体或抗原结合在某种固相载体上,并保持其免疫活性,测定时，将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步,骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应,用洗涤的方法分离抗原,抗体复合物和游离成分,然后加入酶的作用底物催化显色，进行定

3、性或定,量,方,法,类,型,酶联免疫吸附试验的主要技术类,型有双抗体夹心法、间接法、竞,争法、捕获法等,1,双抗体夹心法,此法常用于检测抗原,它是利用待测抗原上的两个抗原决定簇,A,和,B,分别与固相载体上的抗体,A,和酶标记抗体,B,结,合，形成,抗体,A,待测抗原,酶标抗体,B,复合物,复合物的形成量与待测抗原含量成正比，属非,竞争性反应类型,抗,体,A,待测抗原,酶标抗体,包被物,2,间接法测定抗体,此法常用于测定抗体,将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与,抗原结合后再与酶标二抗结合，形成,抗原,待,测抗体,酶标二抗的复合物,复合物的形成量,与待测抗体量成正比，属非竞争性反应类型,抗,

4、原,待测抗体,酶标二抗,包被物,3,竞,争,法,此法既可用于检测抗原和半抗原,也可以用于检测抗体,用酶标抗原（抗体）与待测的非标记抗原,抗体）竞争性的与固相载体上的限量抗体,抗原）结合，待测抗原（抗体）多，则形,成非标记复合物多，酶标抗原与抗体结合就,少，也就是酶标记复合物少，因此，显色程,度与待测物含量成反比,限量的的抗体,酶标抗原,样品抗原,酶标多于样品,显色程度深,样品多于酶标,显色程度浅,显色程度与待测物含量成反比,包被物,4,捕获法（反向间接法,主要用于测定血清中某种抗体亚成分,以目前最常用的,IgM,测定为例，因血清中针对某,种抗原的特异性,IgM,和,IgG,同时存在，而后者可,

5、干扰,IgM,的测定。因此，先针对,IgM,的第二抗体,如羊抗人,IgM,链抗体）连接于固相载体，用以,捕获”样品中所有,IgM,洗涤除去,IgG,等无关,物质，然后加入特异性抗原与待测,IgM,结合；再,次加入抗原特异的酶标抗体；最后形成固相二,抗,IgM,抗原,酶标抗体复合物，加酶底物显色后,即可对待,IgM,进行定性和定量测定,针对,IgM,的第二抗体,待测物,其中含有,IgM,和,IgG,特异性抗原与,IgM,结合,酶标抗体,包被物,IgG,等无关物质,被洗脱,具,体,步,骤,包被,封闭,加待测物,加一抗，二抗,或抗原等,显色,包,被,用包被液稀释包被抗体至合适浓度，包被酶,联板（聚乙

6、烯微量反应板），每孔,100,用保鲜膜包好,4,过夜,如急用，包被,2h,后，清洗也可用，但最好,过夜,次日弃去孔内溶液，并在面巾纸上拍干,用,PBST,洗液，洗,45,次,每次在洗板机清洗酶联板上震荡,23min,后,在面巾纸上拍干后进行下一次清洗或下一步,包,被,液,0.05M PH 9.6,磷酸盐缓冲液,Na,2,CO,3,1.59 g,NaHCO,3,2.93g,加蒸馏水至,1000ml,PBST,洗,液,2000ml PBS + 1ml,Tween-20,PBS,NaCl 8g,KCl 0.2g,Na,2,HPO,4,1.42g,KH,2,PO,4,0.27g,加,1000ml,蒸馏

7、水定容，调,PH,至,7.4,洗,板,机,封,闭,用封闭液封闭，每孔,100,室温下，在微量振荡器上，封闭,2h,弃去孔内溶液，并在面巾纸上拍干,用,PBST,洗液，洗,45,次。（同包被,用保鲜膜包好,4,可保存一个月,封,闭,液,10 ,小牛血清,1ml,小牛血清加到,9ml 1,PBS,中混匀,5,脱脂奶粉（用洗液稀释,加标准样及样品,待测样或标准一抗,用,PBST,洗液进行稀释到适合浓度，每孔,100l,包好保鲜膜。室温下，在微量振荡器,上孵育,2,小时。清洗,二抗,用,PBST,洗液进行稀释到适合浓度，每孔,100l,包好保鲜膜。室温下，在微量振荡器,上孵育,1,小时。清洗,注,意,

8、抗体抗原反应比较快，一般,12,个小时就,达到峰值。延长反应时间容易出现非特异,结合，但反应时间不能少于,1.5,小时,二抗的使用浓度（一般,1,10000,稀释,应当进行预实验确定，二抗的反应时间不,能过长，容易出现非特异反应。一般，反,应,4060,分即可,OPD,显,色,临用前取,A,液,5.14ml,B,液,4.86ml,加入,OPD,邻苯二胺，在,20中保存,0.0040g,约,4,小片），溶解后加入50l的,30%H,2,O,2,配成显色液。,OPD,要充分混,匀，否则容易出现个别孔颜色太深,显色液每孔100l。避光显色,1520min,用,2mol,L H,2,SO,4,终止反应

9、，每孔50l,显,色,液,A,液,0.2mol,L Na,2,HPO,4,Na,2,HPO,4,12H,2,O 71.7g,加水至,1000ml,B,液,0.1 mol,L,柠檬酸,柠檬酸,19.2g,柠檬酸，加水至,1000ml,结,果,判,定,酶标测定仪检测,429nm,测定,OD,值,待测孔,P,与对照孔,N,的比值,P,N,大于,1.5,或,2,者为阳性,注意：要有阴性，阳性对照,应,用,ELISA,法由于测定灵敏、特异、操作简便,酶标记试剂比较稳定、易于自动化、无反,射性污染，且易与其他相关技术偶联，使,其成为目前应用最广泛而且发展最快的一,种免疫测定技术。市场上符合质量要求的,商品试剂盒（提供有包装好的固相载体,酶标记物及其底物和洗涤液等全套试剂成,分