流式细胞术的原理

1、流式细胞术的原理,概念 Definition,流式细胞术 Flow cytometry (FCM) 特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数分析 检测的对象主要是各种生物颗粒，包括大量的临床样本：外周血，骨髓，细胞穿刺液，洗脱液，实体组织，同时包括各种各样的科研研究对象：培养细胞，藻类、染色体、原生动物 cell suspension 细胞悬液在流动的状态中被检测各项特性,流式细胞仪的基本结构 以及原理,流式细胞仪的基本结构 以及工作原理,虽然每款流式细胞仪有各自的特征性结构，但是其内部结构基本组成相同。 基本结构一共分三部分： 液流系统 光学系统 电子系统,液流系统,液流系统包括 流动室

2、flow chamber 液流驱动系统,鞘液三大作用： 避免堵塞喷孔 约束样本位于喷嘴中心、提高测量精度 保持细胞活性,液流系统,对灵敏度要求不是很苛刻的实验，可调高样本进样速率，从而提高采样分析速度,光学系统,主要由激发光源、光束成形及收集系统组成,弧光灯： 氙灯、高压汞灯价格便宜 激发光谱广 但是 单色性差-单一谱线上能量弱 稳定性差-功率不稳定 激光器： 气体激光器：氩离子（488nm）、氦氖（633nm）、氪离子（647nm）、氪氩（568nm） 半导体激光器：价格低、结构简单、使用寿命长。BD FACSCalibur采用的635nm 染料激光器,光学系统,激光器： 单波长、高能量、发

3、散角小、高稳定性光照,光学系统,激光在检测细胞样本前经过透镜聚焦成为非常窄的高能量光束。 激光光束的横截面呈椭圆形光斑，所以除了集聚能量（细胞通过检测区时就可以得到很强的信号），这样还可以避免照射到其他细胞造成干扰,激光光束成形-透镜聚焦,光学系统,收集系统,如何将混合的荧光区分开来，分别进行收集呢？ 滤光片置于荧光探测器前，限定其接收的荧光的波长范围,光学系统,电子系统,流式细胞仪的工作原理,散射光信号,前向角散射光（FSC，Forward Scatter）： 细胞相对大小及其表面积 侧向角散射光（SSC，Side Scatter）： 细胞颗粒度及细胞核相对复杂性,散射光信号,荧光信号,特异

4、荧光信号,背景信号,荧光素,什么是荧光及荧光素？ 某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比照射光波长长的光线-即荧光。而这些受激发后能产生荧光的物质称为荧光素。 什么是荧光发生机理？ 室温下的荧光素分子大部分处于稳定的“基态”。当荧光素在激发光的照射下吸收足够的光能后，跃迁到新的状态，即“激发态”。处于激发态的荧光分子极不稳定，它可以通过极短时间（纳秒）内以发射一定波长的光量子的方式释放所吸收的能量从而返回到基态。 这一过程称为荧光发射，也就是发光,荧光素的激发和发射光谱,所有的荧光素都有两个特征光谱。 激发光谱（Excitation，Ex）： -是指能特异性地激发某种荧光素的一定波

5、长范围内的光线，也称为吸收光谱。 -我们一般标注的是吸收波峰，也就是最大吸收波长：Ex-Max 发射光谱（Emission，Em）： -是指荧光素发射的一定波长范围内的荧光。所有荧光都是宽谱发射。 -一般标注的是发射波峰，即最大发射波长：Em-Max,FITC的激发与发射光谱,常用染料FITC可被488nm激光激发，Em-Max：525nm，可以配用530/30接收通道,488nm,525nm,PI的激发与发射光谱,常用染料PI同样可被488nm激光激发，Em-Max：625nm，所以配用不同的585/42接收通道,488nm,625nm,APC的激发与发射光谱,常用染料APC可被633nm激

6、光激发，Em-Max：660nm，可以配用660/20接收通道,633nm,660nm,荧光染料的选择,仪器配置： 激光器种类； 光信号接收通道； 减少发射光光谱重叠,补偿,荧光染料宽谱发射的特征产生补偿问题,PE渗漏到FITC通道的信号 FL1-x%FL2,FITC渗漏到PE通道的信号 FL2-x%FL1,先电压，后补偿,双色染色的实验中 先使用阴性管调电压阴性对照（1）：细胞加上IgG1 FITC,IgG1 PE 然后用单染管调补偿单染管（2）：细胞+抗体A FITC or 抗体B PE,调电压 -寻找目标细胞群; -多色实验中，分出阴阳性细胞群分界线 调阈值 -减少背景信号 调补偿 -减

7、去干扰信号,调节电压、阈值、补偿,调整荧光接收器电压,电压改变对数据显示的影响,数据存储,List Mode列表模式：每个细胞的参数依次按顺序排列存储,FITC/PE 双染样本,数据显示,二维点图 （Dot Plot） 直方图（Histogram） 等高线图 （Contour Plot） 密度图 （Density） 三维图（3D Plot）等,样本收集及处理,制备单细胞悬液,免疫荧光染色,表型测定,统计学分析,流式细胞术操作流程,1.样本制备,样本来源,血液 骨髓 淋巴结 体液 （尿液、脑脊液、胸腹腔积液） 灌洗液（肺泡支气管） 加抗凝剂（EDTA），室温保存，24h内 实体组织 机械法制备单

8、细胞悬液，保持抗原活性，不宜用酶、表面活性剂,2.免疫荧光染色,染色方式的选择,直接染色 标有荧光染料的抗体直接特异结合目标抗原。 首选的方式：方便快捷、经济、准确、非特异结合少 间接染色 标有荧光染料的二抗间接特异结合目标抗原。 在直接染色不能实现的情况下，选用的方式： 非特异性结合相对增加。在流式试剂日益全面的情况下，越来越少的客户选择这种方式。仅适用于研究最新发现抗原的客户,荧光染料的选择,1，首先，了解目标抗原 1）细胞表面抗原 2）细胞内或是核内抗原（固定、透膜步骤） 3）以上两者兼备。先标记表面抗原，固定后，破膜标记胞内抗原。 4）细胞内细胞因子的测定。使用细胞内蛋白分泌抑制剂，如

9、monensin、BFA，使得细胞因子不能分泌到细胞外。（活化、固定、透膜） 2，了解荧光染料及其工作原理，做出准确的选择,荧光染料的种类,荧光染料分为 三大类,1. 小分子化合物： FITC、Pacific Blue,2. 大分子荧光 蛋白：AmCyan， PerCP，PE, APC,3. 串联染料： PerCP-Cy5.5， PE-Cy5,如何正确选择与使用荧光素,仪器配置：有哪些激光器与接收通道 多色实验中，尽量减少荧光素之间的相互干扰 如APC与Cy5不能串联使用，两者光谱重叠大，补偿不好调。 尽量选择应用广、亮度高的荧光素 荧光素的强弱用Stain Index染色指数来表示，数值越大，信噪比越高。 多色实验中，亮度高的荧光素搭配表达量低的目标抗原 例如，PE， APC这类大分子蛋白相对亮度高。 关注F/P比值 尤其是使用小分子荧光素，一个抗体上会标记多个荧光素分子。 在细胞本身自发荧光强的情况下，使用发射光波长大于600nm的荧光染料。 避免使用串联染料，不稳定，可能发生降解,BD网站提供每一种荧光素的激发以及发射光谱,常用的荧光素组合,临床应用,HIV诊断与治疗 白血病和淋巴瘤的免疫分型