细胞培养的基本技术VIP

1、细 胞 培 养 Cell Culture,第四章 细胞培养的基本技术,4.1 基本操作技术和要求,培养前准备 制订试验计划和操作程序 准备各种器材物品 培养室和超净台的消毒 0.2%新洁尔灭托洗地面 紫外灯照射30-60分钟 以75%乙醇擦拭无菌操作台面,培养室内的无菌操作,洗手和着装 彻底洗手 以75%乙醇消毒手和前臂 可穿经紫外线照射30min的一般清洁工作服。 无菌培养操作 一切操作都应在火焰近处并经过灼烧进行。 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上

2、放置桌面,培养室内的无菌操作,无菌操作中常犯的错误,吸管、剪刀等碰到其他器皿,无菌操作中常犯的错误,正确的拿管姿势,错误的拿管姿势,拿吸管时手碰到无菌区,无菌操作中常犯的错误,培养基浸湿吸管底部的棉花,4.2 原代培养,将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态,细 胞 和 组 织 培 养,计 数 细 胞,细胞数/m

3、l=计数16格稀释倍数 104,原理： （1）计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。 （2）血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1mm2大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm20.1mm=1.0 x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml中之细胞数目。 （3）存活测试之步骤为dye exclusion（染料排除），利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色

4、。一般使用蓝色之trypan blue染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。计算细胞活率：活细胞数/（活细胞数+死细胞数）100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成，随时间延长，部分活细胞也开始摄取染料；因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含血清的稀释液，可以使染色计数更为准确,两 个 概 念,原代培养 直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。一旦已进行传代培养（Subculture）的细胞，便不再称为原代培养，而改称为细胞系。 传代培养 细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次

5、称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去,培养细胞的取材,理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养,组 织 块 培 养 法,新鲜取材的组织中 细胞仍具有分裂增殖的能力。将组织切成小块培养在模拟体内的环境中，小块组织的细胞可以游离出来，从培养液中吸取营养，继续分裂生长。 组织块培养法适用范围广，常用于肝脏、皮肤、角膜、骨骼、韧带、血管、神经、心脏等器官和组织的培养,58,培 养 要 点,材料新鲜 严格无菌操作 剔除脂肪等附着组织

6、 组织块剪小（直径1mm） 摆放开（间距5mm,常 犯 的 错 误,操作中不换器械 冲洗次数不够 组织碎片太大 组织块摆放太密 培养液加入太多,消 化 培 养 法,消化培养法所用的酶有多种，目前应用最广的是胰蛋白酶。它是一种内切酶，可专一水解有精胺酸或赖氨酸的羧基形成的肽键。从而消除妨碍细胞生长的细胞间质，包括基质、纤维等，使细胞分散，易于贴壁并从外界吸收养分和排除代谢物 消化法适用于组织量大的原代培养。胰蛋白酶液适用于消化间质少的组织，如羊膜、胚胎、上皮、肝和肾等组织及传代细胞,59,55,切成1-2mm3小块,20-60min,培 养 要 点,36合适的胰蛋白酶浓度（通常为0.25%） 合

7、适的消化时间：消化时，待组织块变得较疏松，颜色略白为止（通常为37，20-40分钟,常 犯 的 错 误,水浴锅未预热,组织块太大,胰蛋白酶消化不足或过度,吹打用力过重,常 犯 的 错 误,4.3 传代培养和细胞系的维持,传 代 细 胞 培 养,细胞在原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的操作叫传代。为获得稳定的细胞株，或大量的同种细胞，当培养细胞形成致密的单层后需进行传代培养,63,首次传代注意事项,细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面以前（80%），不要急于传代。 传代时不同的细胞有不同的消化时间，因而要根据需要注意观察及时处理。 首次传代时细胞接种数量要多一些，使细胞能尽快适应新环境而利

8、于细胞生存和增殖,63,细 胞 传 代 方 法,根据细胞生长的特点，传代方法有3种 悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l/22/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代 半悬浮生长细胞传代 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代 贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液,64,贴壁生长细胞传代方法,吸光培养瓶中的培养液 PBS洗一次 加入12 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准） 静置210

9、min（显微镜下动态监测） 吸去胰蛋白酶液，加入培养液 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液 吸取1/101/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内 将后者放入培养箱中培养,Trypsin消化细胞,未消化细胞,细胞消化过程,培 养 要 点,严格的无菌操作 适度消化,细胞培养中需要注意的问题,培养液和培养物的比例：一定浓度的培养液仅能支持一定数量的细胞生长，不能盲目增加每单位体积的细胞浓度 PH：初培养pH应为7.4，培养过程应不低于7.0 培养瓶内的空间：一般培养瓶内培养液与液面上的空间体积之比为1:10,细胞培养中需要注意的问题,容积、深度、表面面积：培养液体积与表面面积的比例为0.20.5ml/cm2。需高浓度氧的，在浅的培养液（2mm）中生长较好；需要低浓度氧的,在深的培养液（5mm）中生长较好。 去除死细胞 温度控制：动物细胞培养对温度波动的敏感性很大。温度低于36.5，细胞生长缓慢；温度高于37.5，细胞存活力降低,细胞系的维持,细胞系档案要记录好； 细胞系的传代、换液一般都有自身的规律性，在维持传代时要注意保持其稳定的规律性； 多种细胞系维持传代，要严格操作程序，以防细胞之间交叉污染； 每一种细胞系都应有充足的冻存储备,65,培养细胞的纯化,自然纯化 人工纯化,酶消化法 机械刮除法