酶学与酶工程第二章学生

1、第二章 酶学基础,第一节 酶的结构与功能,一、酶的活性中心 (active center，active site) （一）活性中心和必需基团 与酶活性显示有关的，具有结合和催化底物形成产物的空间区域，叫酶的活性中心，又叫活性部位。 活性中心可分为结合部位和催化部位,结合部位决定酶的专一性， 催化部位决定酶所催化反应的性质,活性中心外的必需基团与维持整个酶分子的空间构象有关,注意： （1）活性中心是一个三维实体。 （2）是有一些一级结构上可能相距较远的氨基酸侧链基团组成，有的还包含辅酶或辅基的某一部分基团。 （3）在酶分子表面呈裂缝状。 （4）酶活性中心的催化位点和结合位点可以不止一个。 （5）

2、酶活性中心的基团都是必需基团，但必需基团还包括活性中心以外的基团,木瓜蛋白酶活性中心氨基酸残基,酶分子中的氨基酸残基或其侧链基团可以分为四类 1接触残基 2辅助残基 3结构残基 4非贡献残基,二）酶活性中心中的化学基团的鉴别 1非特异性共价修饰： 某些化学试剂能使蛋白质中氨基酸残基的侧链基团反应引起共价结合、氧化或还原修饰反应，使基团结构和性质发生变化。 如果某基团修饰后不引起酶活力的变化，就可初步认为此基团可能是非必需基团；反之，如修饰后引起酶活力的降低或丧失，则此基团可能是酶的必需基团,2亲和标记 共价修饰剂是底物的类似物，可专一性地引入酶的活性中心，并具有活泼的化学基团(如卤素)，可与活

3、性中心的基团形成稳定的共价键。因其作用机制是利用酶对底物类似物的亲和性而将酶共价标记的，故称为亲和标记,3差别标记 在过量底物或可逆抑制剂遮蔽活性中心的情况下，加入共价修饰剂，使后者只修饰活性中心以外的有关基团；然后去除底物或可逆抑制剂，暴露活性中心，再用同位素标记的向一修饰剂作用于活性中心的同类基团；将酶水解后分离带有同位素的氯基酸，即可确定该氨基酸参与活性中心,4蛋白质工程 这是研究酶必需基闭和活性中心的最先进方法，即将酶蛋白相应的互补DNA(cDNA)定点突变，此突变的cDNA表达出只有一个或几个氨基酸被置换的酶蛋白，再测定其活性，可以知道被置换的氨基酸是否为活力所必需。 优点,优点：

4、改变酶蛋白中任一氨基酸而不影响其他同类残基 改变疏水残基，使其转变成亲水或另一疏水残基 同时改变活性中心内外的几个氨基酸 个或多个氨基酸的缺乏或插入 改变酶蛋白的磷酸化位点或糖化位点 不致引起立体障碍,三) 组成活性中心的重要化学基团 丝氨酸、组氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和赖氨酸,二、酶的结构和功能的关系,一）酶的一级结构与催化功能的关系 酶的一级结构是酶的基本化学结构，是催化功能的基础,胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活,二）酶的二级和三级结构与催化功能的关系 酶的二级、三级结构是所有酶都必须具备的空间构型。维持酶的活性部位所必须的酶蛋白的二级和三级结构彻底改变

5、，就会使酶遭受破坏而丧失其催化功能，这是蛋白质变性的依据。 1酶的变性和失活 2活性中心的挠性 3酶分子的结构域,三）酶的四级结构与催化功能的关系 具有四级结构的酶，按其功能可分为两类，一类与催化作用有关，另一类与代谢调节关系密切,三、酶催化作用的基本理论,一）酶底物复合物 1酶底物复合物存在的证据 1903年，Henri用蔗糖水解酶水解蔗糖提出的。 E+S= ES= P+ E （S：substrate， P: product） 在反应过程中，酶首先与底物形成酶-底物中间复合物（ES, enzyme-substrate intermediates）,再分解成酶（E）和产物（P），使反应沿一个低

6、活化能的途径进行，降低反应所需活化能,2. 酶与底物形成复合物的作用力 1）离子键 2）氢键 3）范德华力,二）酶作用的专一性机制,1.锁钥学说（lock and key theory,2.诱导契合学说（induced-fit hypothesis,三）酶作用的高效性机制,1. S与E的靠近效应和定向效应 proximity and orientation 靠近效应：指两个反应的分子，它们反应的基团需要互相靠近，才能反应,2. 酸碱催化(acid or base catalysis) 酸碱催化是通过瞬时地向反应物提供质子或从反应物接受质子以稳定过渡态、加速反应的一类催化机制。由于E活性中心含有

7、酸碱基团,它们可以与S中的酸碱基团进行质子交换，加强了E与S的相互作用，减弱了S分子内部的化学键，使S由稳态不稳态 狭义酸碱催化：H和OH （specific acid-base catalysis） 广义酸碱催化：质子供体和质子受体 （general acid-base catalysis,三、降低反应活化能的因素,Table Functional groups involved in general acid-base catalysis,3. 共价催化(covalent catalysis) 共价催化又称亲核催化（nucleophilic catalysis）或亲电子催化（electro

8、philic catalysis） 亲核攻击集团： -OH，-SH，-N（咪唑基） 底物亲电中心： 磷酰基（P=O）酰基（C=O） 糖基（Glu-C-OH,底物中典型的亲电中心为磷酰基、酰基和糖基,酶分子上未共用电子对攻击正电性原子,4金属离子催化 5多元催化 6微环境的影响,7. 底物的变形（distortion）与张力作用（tensility,四、影响酶促反应速度的因素,1.底物浓度对酶反应速度的影响,2. 酶浓度的影响 反应速度与酶浓度成正比,SEVE,Fig. Effect of enzyme concentration on the velocity of an enzyme-cat

9、alyzed reaction,V与E 关系的几点讨论,3.温度的影响,温度-酶反应速率曲线与 最适温度（optimum temperature,Fig. The effect of temperature on enzyme activity,optimum temperature,4. pH的影响 pH-酶反应速率曲线与最适pH（optimum pH,Tab. Optimum pH of some enzymes,Fig. The effect of pH on enzyme activity,pH影响的机理,1）pH影响E活性中心及附近有关基团的解 离，使之易或不易与S 结合； 2）pH

10、影响S的极性基团，从而影响这些基 团与E的结合； 3）过酸、过碱可使酶变性失活,5.激活剂和抑制剂 凡能增高酶活性的物质，称为酶的激活剂 凡能降低或抑制酶活性但并不使酶变性的物质称为酶的抑制剂 1）酶的激活剂,2）酶的抑制剂 抑制作用与抑制剂（inhibition and inhibitor） 酶分子中的必需基团的性质受到某种化学物质的影响而改变，导致酶活性的降低，甚至丧失，但并未引起酶变性的作用称抑制作用,可逆抑制(Reversible Inhibition) 通常以非共价键与酶和（或）酶-底物复合物可逆性结合，使酶活性降低或消失。采用透析或超滤等物理方法可将抑制剂除去，使酶恢复活性。 类型

11、： 竞争性抑制（competitive inhibition） 非竞争抑制（ noncompetitive inhibition,竞争性抑制,例: 丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用,非竞争性抑制,Fig. Noncompetitive inhibition,不可逆抑制作用（irreversible inhibition) 抑制剂以共价键和酶分子上必需基团结合（牢固结合），使酶活性降低或丧失，这种抑制剂不能用透析、超滤等物理方法解除抑制作用,不可逆抑制,专一性的不可逆抑制,非专一性的不可逆抑制,第二节酶在生物体内的几种存在方式,一、单体酶、寡聚酶、多酶复合体 1. 酶蛋白是一条具有三级结构的多肽链

12、，相对分子量为13000-35000，不能再解离成更小的组成单位 2.寡聚酶具有四级结构，是由两个或两个以上的亚基组成的酶，这些亚基可以是相同的，也可以是不同的,3.多酶复合体 多酶复合体是指几个酶联合而成的络合物，其中酶以非共价键彼此嵌合在一起。一般由26个功能相关的酶组成，这样更有利于生化反应的连续进行，以提高酶的催化效率，同时也便于机体对酶的调控。 1）多酶复合体组成成分的结合强度可能差别很大 2）在催化活性上没有直接相关的酶也可以组成多酶复合体 3）在细胞内各种多酶复合物还可能通过和细胞膜或细胞器结合在一起。从而通过相互邻近组成高效的物质和能量代谢系统,二、同工酶 同工酶具有多种生物学

13、功能： 1）同工酶作为遗传标志已广泛被遗传学家用于遗传分析的研究。 2）同工酶和个体发育及组织分化密切相关 3）同工酶与代谢调节 4）同工酶与癌基因的表达 5）同工酶分析法在农业上已开始用于优势杂交组合的预测 6）临床上可作为疾病的诊断指标,三、别构酶和修饰酶 1.别构酶(allesteric enzyme) 别构酶的特点和性质 概念：具有别构调节作用的酶称作别构酶。 许多寡聚酶具有调节亚基，催化亚基只结合底物，调节亚基结合调节剂，因此称别构酶，是调节代谢的重要酶,2.修饰酶 1修饰酶的类型 2修饰酶的特点 (1)绝大多数修饰酶具有无活性有活性(或低活性高活性)两种形式 (2)耗能少 (3)效

14、率高 四、结构酶和诱导酶 五、胞内酶和胞外酶,一、酶活力单位 酶活力（enzyme activity, 也称酶活性） 酶催化反应的能力，酶活力用在一定条件下它所催化的某一化学反应的反应速度来表示。 酶的活力单位（IU, active unit） 1 IU：指在最适反应条件下，1分钟内催化1mol底物转化为产物所需的酶量。 酶的比活力（specific activity） 指每mg蛋白质所具有的酶活力，一般用 U/mg蛋白质来表示,第三节 酶活力测定,二、酶活力的测定方法 酶活力测定时条件的选择： 1选择合适的化学反应及检测指标 2底物浓度的选择 3其他条件的选择 pH，温度，缓冲液，辅助因子或

15、辅酶，激活剂，抑制剂,分光光度法,荧光法,电化学法,放射性同位素法,如果酶促反应的产物具有光（可见光、紫外光）吸收性质，或反应产物进行一定反应后具有光吸收性质。方便，常用,底物或产物具有荧光性质。灵敏度高,反应过程中有pH的变化，可以用pH计检测，可以用滴定法测定。方便，常用,用放射性同位素标记的底物进行酶促反应，测定产物的同位素脉冲数。灵敏度高，但不常用,酶活力的测定方法,三、酶的纯度鉴定 酶产品质量评价中常使用比活力。 判断分离纯化方法的优劣，通常用两个指标来衡量： 总活力的回收：表示提纯过程中酶的损失情况 比活力的提高的倍数：表示提纯方法的有效性,得率和纯化倍数的计算： 总活力=活力单位

16、数/mL酶液 X总体积（mL） 比活力=总活力/总蛋白（mg） 得率=每步骤的总活力/第一步的总活力 以百分比表示，第一步的得率为100% 纯化倍数=每步骤的比活力/第一步的比活力 起始的纯化倍数为1,酶促反应动力学(Kinetics of enzyme-catalyzed reaction ) ： 是研究酶促反应的速率以及影响此速率的各种因素的科学，是酶学的一个分支,第四节 酶促反应动力学,1米氏方程的提出,中间复合物学说,第一步: E+S ES,第二步: ESE+P,VES,1913年Michaelis & Menten 推导了米氏方程 1925，Briggs & Haldane修正,Km

17、为米氏常数,2米氏常数的意义 1）V = 1/2 Vmax, Km = S。米氏常数的单位为mol/L。 Km 值的物理意义就是Km值是酶反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。 2）Km 是酶的一个特征常数。 3）如果一个酶有几种底物，则对每一种底物都有一个Km，Km值最小的为这个酶的最适底物。 4）Km受温度、pH、的影响，Km值是常数是指对于一定底物在一定温度、pH条件下是一常数。 5)根据米氏公式可以人为的掌握反应速度V,6）根据抑制剂对Vmax 、Km的影响，可推断抑制剂的类型 7）催化可逆反应的酶，对正逆反应的底物的Km往往是不同的， 8) 有助于寻找代谢过程的限速步骤。 9）了

18、解酶的Km值及在细胞内底物的浓度，可推知该酶在细胞内是否受到底物浓度的调节,二、米氏方程的适用范围,1多中间步骤,在推导米氏方程时是以式为出发点,多中间步骤,中间步骤愈多，Km和Kcat是由更多环节的反应速度常数组成的更复杂的复合函数。而事实上，一般测得的Km和v本身也可能就是由多个中间步骤提供的复合函数,2稳态前 在任何一个酶反应系统中，酶和底物一经混合，就会立即生成酶底物络合物(ES)及产物(P)，并随时间而逐渐升高。但经过一定时间后，ES的形成与分解达到动态平衡，而P也将以恒定速度生成，系统进人稳态。但是在进入稳态前的动力学与稳态时的动力学关系不同，不能用米氏方程表示。 3反应全过程和逆反应,4. 高底物浓度抑制与活化 5.多底物反应 6.高酶浓度,三、可逆抑制动力学,1. 竞争性抑制Competitive：竞争性抑制剂是较常见、较重要的,速度方程式,Km (表观米式常数,Ki: 抑制剂常数,竞争性抑制曲线,Fig. Competitive inhibition,Fig. Lineweaver-Burk plot of competitive inhibition,2. 非竞争性抑制Noncompetitive,Fig. Lineweaver-Burk