蛋白质研究的基本实验方法

1、蛋白质研究的基本实验方法,实验研究三个水平,整体水平：动物模型 细胞水平：形态、功能 分子水平：基因、蛋白质,蛋白质的调控,基因序列的变化：ErbB2 染色质水平上基因活化的调节： 染色质的结构（对核酸酶的敏感程度增加） 组蛋白的甲基化（H3-K9 基因沉默，H3-K4 基因活化） 组蛋白的乙酰化 DNA的甲基化（5%C 甲基化 m5C； 5端CpG,蛋白质的调控,转录水平的调控 顺式作用元件，反式作用因子（转录因子） 转录后的调控 翻译水平的调控 翻译后调控 磷酸化、糖基化、泛素化 定位,蛋白质调控的研究,Qualitative model (cyclins) Quantitative mo

2、del (CDK,蛋白质研究的基本方法,免疫印迹（Western Blot） 免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation） 染色质免疫共沉淀（ChIP,Western Blot,免疫印迹（蛋白质印迹） 是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法。 是在凝胶电泳（高分辨率）和固相免疫测定技术（高特异性，高灵敏性）基础上发展而来,Western Blot,Western Blot,A. Sample preparation B. Electrophoresis C. Transfer of proteins and staining (Western blotting,蛋白裂解液的制备,

3、组织样品：取适量（约100mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml 含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂），匀浆后抽提总蛋白（或核蛋白）。 细胞样品：每份样品取11061107 细胞，PBS 清洗细胞，去PBS，加0.1ml1ml 含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂）抽提总蛋白（或核蛋白,蛋白裂解液的制备,蛋白裂解液的制备,RIPA Buffer： 裂解液和细胞应充分接触，RIPA buffer足量。 RIPA裂解液中蛋白样品含有较高浓度的去垢剂，不能用Bradford法但可用BCA法测定蛋白浓度,蛋白裂解液的制备,当细胞破碎的时候，蛋白水解酶就会被释放出来或

4、被激活。为了避免这些情况的出现，在样品制备时尽可能在低温下进行。但是有些蛋白酶在上述条件下仍然保持着活性，此时应当使用蛋白酶抑制剂。 Western Blot 临用前可新鲜加入最终浓度为1mM的 PMSF（苯甲基磺酰氟）。 Co-IP 蛋白酶抑制剂：胃蛋白酶抑制剂(pepstantin)、亮抑蛋白酶肽(leupeptin)、胰蛋白酶抑制剂(aprotinin)等；能够强烈抑制所有蛋白酶的活性（如丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶、酸性蛋白酶,蛋白裂解液的制备,组织细胞裂解过程中释放大量内源性蛋白磷酸酶，以各种方式催化磷酸化蛋白的去磷酸化。 Western Blot和免疫共沉淀检测磷酸化蛋白质

5、、蛋白激酶活性测定，抑制磷酸化蛋白质去磷酸化，维护蛋白质的磷酸化状态。 Na3VO4、NaF 蛋白磷酸酶抑制剂：特异性抑制某一种或几种蛋白磷酸酶活性。该混合物优化的组成使其可以强烈几乎所有重要的蛋白磷酸酶活性，包括蛋白丝/苏氨酸磷酸酶(PP1、PP2A、PP2B、PP2C)、蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶等,蛋白质定量,直接紫外吸收法 含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸 280nm附近的紫外吸收峰 测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质 嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质干扰 适合于与色谱柱联用，达到实时监控，较不准确 比色测定法,蛋白质定量,比色测定法 在典型的蛋白测定中，化学试剂

6、加入到蛋白样品溶液里产生颜色变化，这一变化可由分光光度计或酶标仪检测，并与已知浓度的蛋白标准曲线作比较。 Bradford法 蛋白质与染料考马斯亮蓝G-250结合 最大吸收峰从465nm变为595nm 在一定的线性范围内，反应液595nm处吸光度的变化量与反应蛋白量成正比 不能含有太高浓度的去污剂，对样品的要求较高,蛋白质定量,Lorry法 蛋白质与碱性铜溶液中的Cu2+络和使肽键伸展，暴露出酪氨酸和色氨酸，在碱性铜条件下与福林试剂反应，产生蓝色，在一定浓度范围内，其颜色的深浅与蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比，由于各种蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，因此在测定时需使用同种蛋白质作

7、标准。 Lorry法进行了改良,蛋白质定量,Bicinchoninic acid (BCA )法 近来广为应用的蛋白定量方法。 原理与Lowery法蛋白定量相似，即在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA与 Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562 nM处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比。 灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。 BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响,蛋白质定量,绘制标准曲线 分别取一定体积的浓度为2mg/ml的标准BSA溶液，加PBS溶液至20ul配成如下浓度梯度的BSA溶液:0m g/ml、0.0156

8、25mg/ml、0.03125mg/ml、0.0625mg/ml、0.125mg/ml、0. 25 mg/ml、0.5 mg/ml、1mg/ml、2 mg/ml。样品(样品BSA溶液或蛋白质溶液)与PBS共25ul（0.1ml）加样，最后每孔均加200ul（2ml）工作液（BCA：Cu 50：1 嫩绿色）混匀，37 C孵育30 min, 冷却到室温后，酶标仪上562 nm处读数,Western Blot,蛋白免疫印迹（Immunoblotting） 凝胶电泳（SDS -聚丙烯酰胺凝胶） 样品的印迹（蛋白质转移固相支持物：硝酸纤维素膜（NC 膜）和PVDF 膜） 免疫学检测（用特异性的抗体检测所

9、要研究的相应抗原,SDS-PAGE,SDS-PAGE,原理 蛋白质中含有很多的氨基(+)和羧基(-)，不同的蛋白在不同的pH值下表现出不同的电荷。 为了使蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有关，我们在上样前，通常会进行一些处理(上样缓冲液)。即在样品中加入含有SDS 和-巯基乙醇的上样缓冲液,SDS-PAGE,SDS 即十二烷基磺酸钠（CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na）：一种阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。 -巯基乙醇：强还原剂，它可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,SDS-PAGE,溴酚蓝染料：用于监控整个电泳过程。 蔗糖或甘油：增大

10、溶液密度，使加样时样品溶液可以快速沉入样品凹槽底部。 高温处理，其目的是将SDS与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构同时使整个蛋白带上负电荷,SDS-PAGE,1xSample buffer: 60mM Tris-Cl pH 6.8 2% SDS（心脏，肌肉5%） 10% glycerol 0.01% Bromophenol blue 1.5% 2-mercaptoethanol,SDS-PAGE Sample,SDS-PAGE,pH 不连续和胶孔径大小不连续 电泳启动时，蛋白样品处于pH6.8 的上层（孔径大），pH8.8 的分离胶层在下层（孔径小），上槽为负极，下槽为

11、正极,SDS-PAGE,PAGE 胶的聚合原理：甲叉双丙烯酰胺和丙烯酰胺在过硫酸胺的作用下聚合，形成胶,SDS-PAGE,在浓缩胶运动中，Cl解离度大，Pro解离度居中，甘aaCOO解离度小，迁移顺序为（PH6.8）Cl Pro COO，一个Cl领路，COO推动，蛋白在中间，这样就起到浓缩的作用了。 由于胶联度小，孔径大，Pro受阻小，因此不同的蛋白质就浓缩到分离胶之上成层，起浓缩效应，使全部蛋白质处于同一起跑线上。 当蛋白质进入分离胶时，此时Pro，Cl，甘aa 离子在PH8.8 的溶液中，Cl完全电离而很快到达正极，甘aa 电离度加大很快跃过蛋白质，而到达正极，只有蛋白质分子在分离胶中较为

12、缓慢的移动,SDS-PAGE,由于Pro在电泳过程中，带负电荷多者迁移快，反之则慢，这就现了电荷效应。由于胶孔径小，而且成为一个整体的筛状结构，它们对大分子阻力大，小分子阻力小，起着分子筛效应，也就是蛋白质在分离胶中，以分子筛效应和电荷效应而出现迁移率的差异，最终达到彼此分开,SDS-PAGE,SDS-PAGE,催化剂：过硫酸铵（AP）在隔氧的状态下，最好现配现用，使用新鲜的。 加速催化剂：TEMED，四甲基乙二胺。催化剂的作用是使单体聚合成网状聚合物,SDS-PAGE,SDS-PAGE,上样量：总蛋白量 20-50ug（上样量过多使电泳条带变形） 70V，30min；110V，与待分离样品靶

13、蛋白分子量相适应,SDS-PAGE Electrophoresis,转膜（电转移,印迹中常用的固相材料有NC 膜、尼龙膜、PVDF 等。 PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性。 有两种规格：Immobilon-P（0.45um）和Immobilon-PSQ(0.2um for MW20kDa,转膜,NC膜及滤纸的预处理： 剪裁与胶大小一致的NC膜，将其浸入1转移缓冲液平衡5分钟以上。（注意：必须保证NC膜始终完全浸于转移缓冲液中） PVDF 膜的预处理： 剪裁与胶大小一致的膜泡入甲醇中，约1-2 分钟。将其浸入1转移缓冲液平衡5分钟以上,转膜,缓冲

14、液通过凝胶时会将蛋白质带到硝酸纤维素（或PVDF）膜上，膜可以与蛋白质通过疏水相互作用产生不可逆的结合。 有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和硝酸纤维素膜夹成三明治形状，而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方向就可以使蛋白质离开凝胶结合在硝酸纤维素（或PVDF）膜上,转膜,转膜,电流1mA-2mA/cm2，我们通常200mA-350mA，按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间,Western Blot,Western Blot,封闭（2h）：用蛋白溶液（如5的脱脂奶粉或BSA）处理以封闭硝酸纤维素（或PVDF）膜上剩余的疏水结合位点。（先用0.2-0.5%丽春红预染） 一抗（

15、过夜或2h）：只有待研究的蛋白质与一抗结合，而其它蛋白质不与一抗结合，这样清洗去除未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。（反贴法,Western Blot,Western Blot,二抗（1h）：带有标记的二抗与一抗结合，可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。 最常用的一种是酶连的二抗，印迹用酶连二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶纯化底物生成有颜色的产物时，就会产生可见的区带，指示所要研究的蛋白质的位置。eg：辣根过氧化物酶；碱性磷酸酶,Western Blot,检测辣根过氧化物酶的方法 增强化学发光法（ECL；2min） 辣根过氧化物酶在H2O2 存在下，

16、氧化化学发光物质鲁米诺（luminol，氨基苯二酰一肼）并发光，在化学增强剂存在下光强度可以增大1000 倍，通过将印迹放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在,Western Blot 必需要内参,Western Blot,一、二抗的选择及比例 凝胶质量（气泡，脆） 电转方向，气泡，电流电压，温度 NC Tween200.3% 洗膜,免疫共沉淀（co-IP,免疫沉淀(IP) 利用抗原抗体特异性结合的特性，将抗原（靶蛋白）从混合体系沉淀下来，初步分离靶蛋白的一种方法。 免疫共沉淀(co-IP) 在体外探测2个蛋白质分子之间是否存在特异性相互作用的一种方法,免疫共沉淀,原理 如果2个蛋白质分子能够发生特异性相互作用，当用一种蛋白质的抗体进行免疫沉淀，另一个蛋白质也会同时被沉淀下来。 抗原-抗体的免疫反应,免疫共沉淀,抗体的选择 多克隆抗体：多位点结合，抗原抗体复合物 稳定；广泛，假阳性 单克隆抗体：单一结合特异性，相同靶蛋白 的不同修饰；非特异性少，交 叉反应,免疫共