细菌感染的实验诊断

1、第二章细菌感染的实验诊断,感染的诊断有赖于 从标本中检出病原体或检出病原体的可溶性抗原,或病原体的DNA 病人血清中检出病原体的抗体 本章主要讨论检出病原体的问题,第一节,实验诊断的目的与要求,进行病原学诊断 进行药敏试验,指导合理用药 用作流行病学调查, 追踪传染源 研究病原生物与感染的关系,一.目的,鲍氏痢疾志贺菌13型暴发,时间：1992年9月 发病：26名 死亡：10名 地点：某婴儿室 传染源：慢性携带者产妇 传播方式：通过污染操作台接触,鼠伤寒暴发,时间：1991年11月 地点：某婴儿室 发病：55名 死亡：23名 56件物品（被褥，尿布，奶瓶）中26件检出鼠伤寒沙门菌,二.诊断试验

2、的选择,有价值的 快速简便的 特异性和敏感性高的,可用的方法,查病原体:直接涂片 分离,对纯培养物进行鉴定 查可溶性抗原: 用已知抗体 查DNA:分子生物学方法 查抗体: 用已知抗原 IgM IgG: 效价有4倍以上增高,三.细菌鉴定流程,双歧检索: 以某一试验分 表解: 用多种试验整体分析 数字编码: 将多种试验分别编码, 数字化后查表,革兰氏阴性杆菌 葡萄糖发酵,氧化酶,弧菌,肠杆菌,非发酵菌,A B C D E,甲 乙 丙 丁,+ - -,+ + -,- + +,+ - +,组别 试验 代码 结果 结果代码 总值,1 A 4 - 0 1 B 2 - 0 C 1 + 1,2 D 4 + 4

3、 5 E 2 - 0 F 1 + 1,15,微量生化反应系统和自动化,各试验孔含不同试验的脱水底物 加入纯化的被检菌 孵育4-24h观察结果 人工读取根据编码资料判定菌种或 电脑读取,第二节,临床标本的采集与处理,一.标本采集的原则,早期,用抗菌药物前 根据病原体存在的部位采集相应标本 无菌技术,避免正常菌群污染,防止病原体播散 采用合适的方法,二.标本的处理,尽快接种到合适的培养基上 根据抵抗力选择保存和运输条件 厌氧菌 奈瑟菌 病毒,第三节,细菌的形态学检查,一.不染色标本,用悬滴法或压片 细菌是活的,可观察运动 加入特异抗体可抑制其运动 结合标本来源可作初步诊断,如霍乱,梅毒 用相差或暗

4、视野显微镜效果更好,压片,悬滴法,二.染色标本,革兰染色(Gram stain):紫色革兰阳性;红色革兰阴性. 注意细菌的大小,形状,排列以及着色的均一性 抗酸染色(acid-fast stain):红色抗酸阳性,蓝色抗酸阴性 荧光染色:更易观察,特殊染色可用于观察荚膜, 鞭毛等细菌的特殊结构,第四节,细菌的分离培养,一.细菌生长的要求,培养基:营养物质,pH7.4 气体: 需氧菌, 厌氧菌, 兼性厌氧 菌,微需氧菌 温度: 一般37C 时间: 一般1824h,二.培养基,1.对培养基的基本要求 足够的营养物质 合适的pH 无菌 澄清,2.培养基的种类,按培养基成分分: 基础培养基: 满足一般

5、细菌要求 营养培养基: 满足苛求细菌要求 鉴别培养基: 加有被利用物和指示剂 选择培养基: 加有抑制剂,能抑制非目的菌生长 特殊培养基: 满足特殊细菌要求,按培养基物理性状分: 液体:增菌 固体:加2%琼脂,平板用于分离纯种,斜面用于传代或保存细菌 半固体:加0.5%琼脂,用于观察动力,保存菌种,三.主要的接种方法,分区划线法:用于分离纯种,多次烧灼减少菌数,以获取单个菌落 连续划线:不要求单个菌落,用于保存或繁殖细菌 涂布:使细菌长成菌苔,可观察细菌被抑制情况或用于繁殖细菌 倾注平板:少量细菌混于琼脂中倒板,计数,分离纯种,四.细菌生长的表现,固体基: 菌落形成,注意其 大小, 形状 表面,

6、 边缘 质地, 透明度 溶血情况 液体基: 浑浊,菌膜,沉淀,五.纯种的获得,纯种是细菌学工作的基础 获得方法: 划线分离法(倾注平板法)获得大的单个菌落 斜面 纯培养物 纯培养物的外观表现应是一致的,六.培养细菌的目的,确定有无细菌 鉴定细菌 药敏试验 计数细菌 利用细菌:制备菌苗,生产抗生素或基因工程产品,第五节,细菌代谢产物的检测,一.细菌毒素的检测,内毒素:致热作用:兔体温 鲎试验 外毒素:体内:毒素与抗毒素的中和试验 体外:Elek平板法:沉淀反应 ELISA,毒素和抗毒素的中和试验 外毒素 ? 外毒素?+已知抗体 小白鼠 小白鼠 结果 发病 发病 有毒性,但不是相 应的 发病 不发

7、病 是相应毒素 不发病 不发病 无毒性,抗毒素,待测细菌,沉淀线,Elek 试验,二.生化反应,欲检测细菌的生化反应, 一般是在合适的培养基中加入被测物和检测其代谢产物的试剂, 即在鉴别培养基中进行培养, 或直接加试剂于培养物中, 观察呈色等现象判定结果,一)碳水化合物的代谢试验,糖(醇)发酵试验:酸,气体 氧化-发酵(O/F)试验: -半乳糖苷酶(ONPG)试验 七叶苷水解试验 甲基红试验 V-P试验,二) 蛋白质和氨基酸的代谢试验,明胶液化试验 Indol试验 Ura试验 H2S试验 苯丙氨酸脱氨酶试验 氨基酸脱羧酶试验,三)碳源氮源利用,枸橼酸盐利用试验 丙二酸盐利用试验,枸橼酸盐利用试

8、验,四)酶,氧化酶试验 过氧化氢酶试验 硝酸盐还原试验 卵磷脂酶试验 凝固酶试验 CAMP试验 胆汁溶菌试验,五)抑菌试验,O/129试验 杆菌肽试验 Optochin试验,第六节,感染的血清学检测 已知抗体检测细菌的抗原用于鉴定细菌 已知抗原检测病人血清中的抗体 用于诊断感染性疾病,一.血清学鉴定,了解微生物的抗原结构 用已知抗体检测细菌的抗原组合 特异性较高 多在鉴定的最后进行 可用多种血清学方法,细菌多用凝集反应,病毒多用中和试验,二.血清学诊断,查抗体: 用已知抗原 IgM: 感染的指标 IgG: 效价有4倍以上增高或 高于当地人群水平 多用于病程较长的全身性感染,第七节,感染的分子生

9、物学检测 检出病原体DNA证明病原体存在,一.核酸检测的用途,细菌分类 临床诊断,快速鉴定 耐药性检测 毒素检测 流行病学调查,二.核酸检测的方法,G+C mol% PCR 限制性内切酶片段长度 核酸杂交,限制性内切酶酶切分析,限制性内切酶是能够在一定部位切开DNA的酶 同样的内切酶可将相同的DNA切成同样数目的，同样大小分子量的片段 电泳后对所得图谱进行分析可判断DNA是否相同,1989年国外某医院泌尿科3周内从病人血，尿中分出8株不动杆菌，具有相同的耐药性，经 Smal I 酶切后出现相同片段，但与环境中或其他科室分出的不动杆菌不同，表明泌尿科的病人是由同一克隆引起的爆发,某医院ICU病房

10、，从水池和病人标本中分出多株铜绿假单胞菌，将其染色体DNA用X Bal 酶切，发现彼此之间没有共同的酶切片段图谱，病人之间图谱的也不相同，说明这不是一次爆发,第八节,动物实验,一.动物实验的用途,分离细菌, 获取纯种 检测其致病性, 观察发病或死亡,可同时 加抗体进行中和试验或保护试验 制备抗体 诱导变异 建立感染模型 检测生物制品的安全性,二.实验动物的选择,多用易感的小动物, 如小白鼠, 豚鼠 按需要选择 纯系,突变系,杂种 无菌动物(GF), 悉生动物(GB), 无特殊病原体动物(SPF), 最低限度疾病动物(MDA), 普通动物 可选用多种途径注射,如腹腔,静脉,皮下,颅内等,可供细菌鉴定的方法,形态: 个体, 菌落, 液体基生长情况 生长需要:氧,温度,营养物 生化反应: 观察其酶活性 抗原性: 用已知抗体 致病性: 动物实验 核酸: PCR, 酶切片