细胞凋亡与疾病

1、细胞凋亡与疾病,一 细胞凋亡概述 二 细胞凋亡的过程与调控* 三 细胞凋亡调控异常与疾病* 四 调控细胞凋亡防治疾病的思路,Kerr, J.F.R., Wyllie, A.H. &Currie, A.R., Apoptosis: A Basic Biological Phenomenon With Wide Ranging Implications In Tissue Kinetics. British Journal of Cancer(1972),26,239,第一节 概 述,一、研究背景,细胞凋亡学说的建立是20世纪生物医学科学发展史上的里程碑。 现在认为：细胞凋亡在有机体的正常发生、组

2、织重建、老化和应答不可恢复的损害中具有重要意义；细胞凋亡的失控，可能成为肿瘤、神经退化性疾病及免疫缺陷等多种疾病的病因,细胞凋亡研究中的重要事件,线虫发育中细胞的凋亡：荧光显微镜图片,二、与细胞凋亡有关的基本概念 由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程称为细胞凋亡(apoptosis) 。 生理条件下，清除异常细胞方式； 病理条件下，细胞凋亡可致疾病,细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程，最后细胞裂解为若干凋亡小体，被其他细胞吞噬。 现在很多情况下，细胞凋亡亦称为程序性细胞死亡(programmed cell death , PCD)。

3、PCD这一概念已为科学家广泛接受。目前对PCD概念又有新的延伸,一）细胞凋亡与程序性细胞死亡,二) 细胞凋亡与有丝分裂(mitosis,有丝分裂代表细胞的分裂与分化，其与机体的生长发育密切相关。而细胞凋亡是由细胞内某些特定基因所决定，具有特殊的生物学意义，是一种细胞的主动死亡过程。 正常时，二者动态平衡，以维持机体细胞数量的平衡和自稳 (如蝌蚪青蛙尾巴消失现象),细胞凋亡与细胞坏死(necrosis)是多细胞生物细胞死亡的两种不同形式，在形态学、生化代谢、分子机制、结局和意义等方面都有本质的区别,三）细胞凋亡与细胞坏死(necrosis,细胞凋亡与坏死的比较 区别点 坏死（他杀） 凋亡（自杀）

4、 1.性质 病理性，非特异性 生理性或病理性，特异性 2.诱导因素 强烈刺激，随机发生 较弱刺激，非随机发生 3.生化特点 被动过程，无新蛋白 主动过程，有新蛋白合成， 合成，不耗能 耗能 4.形态变化 细胞结构全面溶解、 胞膜及细胞器相对完整 破坏 细胞肿胀 细胞皱缩，核固缩 5.DNA电泳 弥散性降解，电泳呈 DNA片段化(180200bp)， 均一DNA片状 电泳呈“梯”状条带 6.炎症反应 溶酶体破裂， 溶酶体相对完整， 局部炎症反应 局部无炎症反应 7.凋亡小体 无 有 8.基因调控 无 有,NPCD,细胞 死亡,细胞坏死,PCD,凋亡：1型细胞死亡,自噬：2型细胞死亡 自噬小体形成

5、,副凋亡：无caspase活化,胀亡：oncosis,有丝分裂灾变：不依赖p53或依赖,细胞死亡概貌图,1. 确保正常发育生长 机体的发育、生长过程并不仅仅与细胞的增殖与分化有关，凋亡在器官组织的形成、成熟过程中也发挥了重要作用。它可以清除多余和失去功能价值的细胞。 人胚胎肢芽形成指(趾)间隙的过程 哺乳类雄性个体穆勒氏管的消失 昆虫羽化时的改组,三、细胞凋亡的生理和病理意义,2. 维持内环境稳定 受损、突变或衰老的细胞如果存留体内就可能干扰机体功能，甚至演变为多种疾病(如肿瘤)。为了维持内环境的稳定，机体必须及时将这些细胞清除，清除这些细胞的主要方式就是凋亡,清除针对自身抗原的T细胞，维持免

6、疫稳定 更新皮肤、粘膜上皮：新C增殖/衰老C凋亡 子宫内膜随H水平的周期变化 清除不能修复的受损C/癌前病变C 通过细胞凋亡被机体清除的细胞数量是相当可观的，每秒钟可达数百万个,3. 发挥积极的防御功能 细胞凋亡参与了机体的防御反应，例如当机体受到病毒感染时，受感染的细胞发生凋亡，使DNA发生降解，整合于其中的病毒DNA也随之被破坏，因而阻止了病毒的复制,1、诱导期,2、效应期,3、降解期,第二节 细胞凋亡过程与调控,一、细胞凋亡的过程(三个阶段,二、凋亡时细胞的主要变化 1. 细胞凋亡的形态学改变 凋亡细胞表面的微绒毛消失，并逐步脱离与周围细胞的接触。可见到： 空泡化(blebbing)：

7、胞浆脱水，胞膜迅速 发生空泡化。 固缩(condensation)： 细胞体积逐渐缩小引起,出芽(buding)：内质网不断扩张并与胞膜融合，形成膜表面的芽状突起。 染色质边集(margination)：晚期核质高度浓缩融合成团，染色质集中分布在核膜的边缘，呈新月形或马蹄形分布,胞膜皱缩内陷，分割包裹胞浆，形成泡状小体，这是凋亡细胞特征性的形态学改变。 （电镜下见透亮空泡 和浓密核碎片,凋亡小体(apoptosis body,Normal Cell,Apoptotic Cell,2. 细胞凋亡的生化改变 细胞凋亡过程中DNA的片段化断裂及蛋白质的降解（Caspase）尤为重要。 典型的细胞凋亡

8、以细胞核固缩、染色质DNA的特征性片段化为主要特征。细胞凋亡发生时DNA双链的断裂发生在核小体连接部，是内源性核酸内切酶被激活所致,DNA链上每隔200个核苷酸就有1个核小体，当内切酶在核小体连接区切开DNA时,即可形成180200bp或其整倍数片段。 这些片段在琼脂糖凝胶电泳中可呈特征性的“梯状” (ladder pattern)条带，这是判断凋亡发生的客观指标之一。 因此, DNA片段化断裂是细胞凋亡的关键性结局,DNA ladder assayed with the Apoptotic DNA Ladder Kit Lane Identification: M = Size marker

9、； = Control cells without camptothecin + = Cells treated with camptothecin； C = Positive control from the kit,DNA ladder assayed with the Apoptotic DNA Ladder Kit TNF （50、100、150 IU/ml）induced L929 for 14h,强烈应激致LC,GC分泌诱导其凋亡。 甲状腺素促蝌蚪青蛙的器官退化。 TNF可诱导多种细胞发生凋亡。 兴奋性神经递质(Glu)诱导神经元凋亡,三、细胞凋亡的调控,一） 细胞凋亡信号 1、生

10、理性凋亡信号,1) 某些激素和细胞因子直接作用,1、生理性凋亡信号,1) 某些激素和细胞因子直接作用,2) 某些激素和细胞因子间接作用,ACTH/睾丸酮/雌激素等，防靶细胞凋亡，维持其正常存活之必需。 当其缺乏时，激活killer gene引发凋亡,2、病理性凋亡信号,诱导凋亡的因素： 生物及化学毒素/病毒感染/射线/应激/抗癌药物/营养缺乏/功能负荷过重等。(两重性,抑制凋亡的因素： 各种化学促癌物/病毒(EBV/HPV)/ Zn2+/苯巴比妥/半胱氨酸蛋白酶抑制剂/中性氨基酸,诱导细胞凋亡与否与有害因素的种类、强度和作用持续时间等有关,氧化应激的作用 辐射/感染/毒素ROS DNA损伤激活

11、P53基因/活化聚ADP核糖转移酶 脂质过氧化使Ca2+内流增加 活化核转录因子NF-B和AP-1,诱导细胞凋亡的环节,死亡受体的激活 一组TNFR基因超家族成员 Fas、TNFR1、DR3/4/5等（膜蛋白） 相应配体（生理或病理）与之结合即触发凋亡,线粒体功能和结构的改变 跨膜电位( m )明显下降（PTP异常） 钙稳态失衡（胞浆Ca2+激活多种酶,TWEAK TNF相似 的凋亡诱导分子,TRAIL TNF相关 的凋亡诱导配体,二）细胞凋亡信号的转导,1、死亡受体介导的凋亡通路,FasL、TNF 、DR3-5配体介导的细胞凋亡信号途径,促凋亡因子,衔接 蛋白,Fas蛋白/Fas配体信号系统

12、（TNFR） Fas是一种细胞表面受体，为跨膜蛋白。也称为APO-1（CD95），是1989年两家实验室同时发现在细胞株表面介导凋亡的蛋白分子， 属于肿瘤坏死因子受体家族。 Fas蛋白伸向胞浆的部分有一段与TNF受体相似，与TNF受体和NGF(神经生长因子)受体高度同源，存在于多种组织细胞,FasL/抗FasAbFas蛋白 神经酰胺 PKs 抗FasAb/TNF Fas蛋白 降解H1组蛋白 ICE样Caspase DNA舒展位点暴露核酸内切酶切割DNA Fas蛋白激活胞内Ca2+信号系统死亡信息,Fas相关的信号转导通路,细胞 凋亡,线粒体功能改变在细胞凋亡的发生中起关键性作用。线粒体途径最为

13、重要！ 线粒体并非只是能量细胞器，在凋亡中是枢纽，它通过释放凋亡启动因子(如CytC、AIF、Smac/Diablo)进入胞质而调控着细胞的生死,2、线粒体介导的凋亡通路,PTP开放,bcl-2,线粒体介导的凋亡通路,AIF,DNA断裂,细胞凋亡,Procaspase-3,Caspase-9,Procaspase-9,凋亡复合体,cAMP/PKA信号系统 胞内Ca2+信号系统 神经酰胺信号系统 DG/PKC信号系统 PTK信号系统,此外内质网可以介导凋亡通路,在细胞凋亡过程中执行染色质DNA切割任务的是内源性核酸内切酶。 核酸内切酶在细胞核内，不能直接激活，需一系列胞内信号转导方能激活（Ca2

14、+/mg2+依赖，Zn2+抑制）。 活化的内切酶使DNA断裂为核小体倍数的片段,1、内源性核酸内切酶激活及其作用,三）细胞凋亡的执行,凋亡蛋白酶是一组对底物天冬氨酸部位有特异水解作用，其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶(caspase是cysteine-containing aspartate-specific protease的缩写)。目前已发现该蛋白酶家族至少有14个成员(caspase1-14) 。 胱冬肽酶蛋白酶家族,2、Caspases的激活及其作用,Caspase的激活,Caspase分为两类,启动型：caspase 8-10 效应型：caspase 3/6/7,灭活凋亡抑制蛋白/凋亡

15、抑制物(如Bcl-2)。 水解蛋白质结构使细胞解体，裂解核纤层蛋白lamins的板层结构，形成凋亡小体,Caspase在凋亡中所起的主要作用是,3、其他 组织型转谷氨酰胺酶催化谷氨酰与赖氨基交联形成稳定构架，形成凋亡小体。 胞浆Ca2+活化需钙蛋白酶（calpains）引发相关凋亡过程,目前，细胞凋亡相关基因多达数十种，根据功能的不同可将其分为三类： 抑制凋亡基因：Bcl-2 、EIB、IAP等 促进凋亡基因：wtp53、Bax、Bak等 双向调控基因：c-myc、Bclx,四） 细胞凋亡的基因调控,拮抗凋亡：Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、BAG、 CED9、 MCL1、 A1、EIB

16、-19k 促进凋亡：BAX、BAK、BAD Bcl-2家族成员的一个显著特征是形成同源或异源二聚体，促进凋亡蛋白和拮抗凋亡蛋白的比率决定着细胞是否生存,Bcl-2是B细胞淋巴瘤/白血病-2基因的缩写形式，它是首个被确认抑制凋亡作用的基因。Bcl-2家族是高等动物生存和死亡信号至关重要的整合因子。已发现至少15个Bcl-2蛋白家族成员,直接的抗氧化； 抑制线粒体释放促凋亡蛋白(Cyt.C、AIF)； 抑制促凋亡调节蛋白Bax、Bak细胞毒作用； 抑制 Caspases的激活； 维持细胞钙稳态,Bcl-2抗凋亡的主要机制是,野生型p53基因编码的P53蛋白是一种DNA结合蛋白，该蛋白在细胞周期的G

17、1期发挥检查点(check point)的功能，负责检查染色体 DNA是否有损伤，一旦发现有缺陷的DNA，它就刺激CIP(CDKinteracting protein-1)的表达，阻止细胞进入细胞周期，并启动DNA修复机制。 突变型p53则抑制细胞凋亡,2、p53,与DNA相结合的p53蛋白,在人类基因组所包含的数万条基因中，它是研究的最为透彻的一个。在已经进入临床试验的抗肿瘤基因治疗药物中，超过40个都选择了以它为靶点,molecular policeman”- p53,C-myc是一种癌基因，其蛋白具有双向调节作用。C-myc蛋白作为重要的转录调节因子，既可激活介导细胞增殖的基因，也可激活

18、介导细胞凋亡的基因，在此情况下细胞何去何从，取决于细胞接受何种信号以及细胞所处的生长环境（GF的支持,3、C-myc,凋亡细胞的彻底清除对维持内环境重要！ 已经凋亡的细胞可被邻近的吞噬细胞或其他细胞所识别、吞噬、分解。这一过程需时约数分钟至数小时。 若清除不彻底，可引起炎性反应、次级损伤、抗核抗体及炎性自身抗体。 巨噬细胞是“专职淸道夫”细胞，其它细胞亦可。识别死亡标记的“可食性,五）吞噬细胞对凋亡细胞的识别与吞噬,一个细胞表面的糖类与另一个细胞表面的凝集素结合激活是吞噬细胞识别的基础,1、吞噬细胞凝集素（Lectin）的作用,2、血小板反应蛋白介导吞噬,3、磷脂酰丝氨酸受体的作用,吞噬细胞分

19、泌的糖类血小板反应蛋白(TSP)可介导巨噬细胞上的victronectin受体对凋亡细胞的吞噬,正常血细胞膜上的磷脂不对称分布，细胞凋亡时被破坏，露出相关成分，被PS受体识别,细胞凋亡是机体维持细胞群体数量稳态的重要手段，细胞凋亡失调(凋亡不足或和凋亡过度)可成为某些疾病的重要发病机制。 一、细胞凋亡不足 这类疾病无论细胞增殖的状态如何，其共同特点是细胞凋亡相对不足，细胞生死相抵之后仍然是生大于死，导致细胞群体的稳态被破坏，于是病变细胞异常增多或病变组织体积增大，器官功能异常,第三节 细胞凋亡调控异常与疾病,过去一直以为细胞增殖和分化的异常是肿瘤发病的主要症结所在，现在从另一个角度细胞凋亡来审

20、视肿瘤的发生。 目前认为细胞增殖过度是肿瘤发病的一个途径，凋亡受抑、细胞死亡不足是肿瘤发病的另一途径，结果导致病变组织内肿瘤细胞存活延长，使细胞群体内存活与死亡的平衡被破坏，存活大于死亡，肿瘤细胞数目的净增长增多,1、细胞凋亡不足与肿瘤,Bcl-2基因：研究发现多种肿瘤组织(如前列腺癌、结肠癌等)Bcl-2基因的表达显著高于周围正常组织，提示这些肿瘤与细胞凋亡减弱有关。 野生型p53基因：是目前最受关注的抑癌基因，它主要通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥抑癌作用。当p53基因突变或缺失时，细胞凋亡减弱，机体肿瘤的发生率明显增加,肿瘤发生的相关基因,例如： 研究发现在非小细胞肺癌p53基因的突变率为50

21、以上，在小细胞肺癌甚至高达80。机体正是通过细胞凋亡清除那些对机体内环境可能构成威胁的细胞。 因此，从发病学角度来看，细胞凋亡实际上是机体天然的抗癌机制之一，与肿瘤的发展和转移也密切相关,自身免疫病最主要的特征是自身抗原受到自身抗体或致敏T淋巴细胞的攻击，造成器官组织损伤。正常情况下，免疫系统在发育过程中已将针对自身抗原的免疫细胞有效清除，其主要方式就是细胞凋亡,2、细胞凋亡不足自身免疫病,T细胞的发育、分化在胸腺内进行，胸腺具有选择性保留或去除T细胞中不同克隆的功能，即正选择（positive selection）和负选择(negative selection)。 通过正选择具有与非己抗原-

22、MHC抗原结合的TcR的单阳性细胞可以存活下来，并进入外周T细胞库,如果胸腺功能异常，负选择机制失调，那些针对自身抗原的T细胞，就可存活，并得到不应有的增殖，进而攻击自身组织，产生自身免疫病，如SLE、多发性硬化症、胰岛素依赖型糖尿病、慢性甲状腺炎和系膜增殖性肾小球肾炎等,因此，从细胞凋亡角度看自身免疫病的发病是由于细胞凋亡不足，未能有效清除自身免疫性T细胞所致。 到目前为止，糖皮质激素仍是治疗自身免疫性疾病的有效药物之一，其主要机制就是诱导那些异常存活的自身免疫性T细胞凋亡,1) 心肌缺血与缺血-再灌注损伤： 既往认为心肌缺血或缺血-再灌注损伤造成的心肌细胞死亡形式是坏死。目前研究表明，该种

23、心肌细胞的损伤坏死与凋亡共存。(坏死没救、凋亡可控,二、细胞凋亡过度,1、细胞凋亡过度与心血管疾病,早期凋亡为主，晚期坏死为主 梗死灶中央以坏死为主，周边凋亡为主 慢/轻缺血凋亡为主，急/重缺血常坏死 IR引起细胞凋亡有时比单纯缺血更严重,心肌缺血与缺血-再灌注损伤时细胞凋亡特点,心肌缺血或缺血-再灌注损伤引起细胞凋亡的机制不清，可能与下列因素有关: 体内实验证明，应用SOD可显著减少缺血-再灌注引起的心肌细胞凋亡，提示与氧化应激有关,缺血或缺氧可引起心肌细胞死亡受体Fas显著上调，使心肌细胞有可能通过与FasL(Fas配体)反应而导致细胞凋亡； 实验证明，缺氧可增加p53基因的转录，因此心肌

24、缺血所引起的细胞凋亡可能与p53基因的激活有关,2) 心力衰竭： 既往人们对心力衰竭发病机制的研究注意力往往投放到心肌细胞功能异常上，而对心肌细胞数量的变化及其对心衰的影响则关注不多。 目前认为：各种原因引起的心肌细胞凋亡造成心肌细胞数量减少可能是心力衰竭发生、发展的原因之一,压力负荷过重引起的心衰动物观察到左心肥大的同时，心肌细胞数量减少，是由细胞凋亡造成的。 从心衰病人心肌标本证实，心肌凋亡指数(apoptotic index，发生凋亡的细胞核数100个细胞核)高达35.5，而对照水平仅0.2-0.4。这一现象给心衰发病机制赋予了新的内容，即心衰时不但有心肌细胞功能异常，而且还有心肌细胞数

25、量减少。故阻遏凋亡可防治心衰,2、细胞凋亡过度与神经元退行性疾病,在神经系统疾病中有一类以特定神经元进行性丧失为其病理特征的疾病，如： Alzheimer disease(AD) Parkinson disease Huntington病 多发性硬化症等,AD造成神经元丧失的主要机制是细胞凋亡。其因素包括淀粉样蛋白、钙超载、氧化应激及NGF分泌不足等。 其可能机制是： 有关致病因素(如氧自由基)作用于神经元，引起Ca2+内流增加，然后激活与-淀粉样蛋白合成有关的基因，神经元内-淀粉样蛋白含量增加，从而导致神经元凋亡。因此，阻抑胞内游离钙浓度上升或清除氧自由基，就可能阻断细胞凋亡,AD神经元凋亡

26、性丧失的发病机制,Fas抗原的介导：GFAP(胶原纤维酸性蛋白) p53基因的活化： c-jun和c-fos及其编码蛋白的作用： APP695基因突变的作用：-淀粉样物质前体 低亲和力NGF受体（P75NGFR）高表达 NF-B的活化,3、病毒感染 由人免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的AIDS具有传播速度快，无特效疗法和死亡率高(5年内100)等特点，其关键的发病机制是CD4+淋巴细胞被选择性破坏，致其数量锐减，引起相关免疫功能缺陷,1)糖蛋白120(gP120)： 感染HIV的宿主细胞膜上可表达一种名为gp120的糖蛋白，CD4+淋巴细胞的表面存有这种蛋白的受体，当gP120与CD4+受体分

27、子结合后即可触发CD4+淋巴细胞凋亡,HIV感染导致CD4+淋巴细胞 发生凋亡与下列因素有关,细胞融合,被感染的CD4+ 细胞 gp120 阳性,未感染的CD4+ 细胞 gp120 阴性,受HIV感染的大部分CD4+淋巴细胞(约80-90)逐步融合形成合胞体(syncytia)或多核巨细胞，合胞体在形成过程中或形成后即可发生凋亡而解体,gp120,CD4,2) 合胞体形成,HIV感染可使CD4+淋巴细胞的fas基因表达上调，因而使CD4+淋巴细胞对fas介导的凋亡敏感性提高,3) Fas基因表达上调,4)T 细胞激活： HIV感染可引起CD4+淋巴细胞处于被激活状态。正常情况下被激活的细胞会迅

28、速发生增殖反应，但在HIV感染时被激活的CD4+淋巴细胞不但不发生增殖，反而发生凋亡。 这种发生在细胞激活以后的T淋巴细胞死亡又称为激活诱导的细胞死亡(activation-induced cell death，AICD,5）细胞因子分泌： 受HIV感染的巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子(TNF)增多，TNF可通过与TNF受体-1(死亡受体)结合而启动死亡程序，也可刺激CD4+淋巴细胞大量产生氧自由基，通过氧化应激而触发细胞凋亡,HIV感染的巨噬细胞,6) Tat蛋白（transactivator）： 受HIV感染的细胞可产生反式激活蛋白tat，这种蛋白可自由透过细胞膜。tat蛋白进入CD4+淋巴细胞后，可诱导细胞产生氧自由基，增强Fas抗原表达而提高对细胞凋亡的易感性,7) 自相残杀 在HIV慢性感染阶段，受感染的CD4+淋巴细胞可作为效应细胞(effect cell)，未受HIV感染的CD4+淋巴细胞作为其靶细胞而被诱导产生凋亡。这是慢性HIV感染CD4+淋巴细胞数量减少的主要原因,健康人外