生化药物分析及生物检定技术

1、生化药物分析,常测定： 氨基酸及其衍生物、药用活性多肽、药用蛋白、药用酶、辅酶、核酸及其降解产物和衍生物、多糖和脂类药物、基因工程DNA重组药物等。 优点： 易被机体吸收，针对性强，疗效可靠，毒副作用小，营养价值高等,一、生化药物分析的特点 1、分子量不确定性 (1)只有氨基酸、核苷酸、辅酶、甾体 激素等化学结构明确的小分子化合 物，分子量确定。 (2)大多分子量不确定，结构不确定 因此，生化药物常需进行纯度及分子量测定,2、分析项目的特殊性 (1)除采用理化法分析外,尚需用生物 检定法进行检定,以证实其生物活性 (2)因易引入杂质，常需做热源、热 敏、异常毒性、安全性试验 (3)多用含量测定

2、表示主药含量，但酶 类需进行效价/酶活力测定，来表 示有效成分含量,3、分析方法的多样性 如：理化、生化、生物检定法等,二、生化药物分析的方法 1、鉴别 (1)化学反应法 (2)UV (3)酶法：如尿激酶-蛋白水解酶 (4)电泳法：如肝素-糖凝胶电泳法 (5)生物法：利用生物体进行试验,2、杂质检查 (1)一般杂质 (2)特殊杂质 3、安全性检查 (1)热原检查：由微生物所分泌的某一种代谢产物，一般以为是内毒素，能使恒温动物体温升高。 方法：家兔法/鲎试剂,2)异常毒性试验 用一定剂量药物按指定的操作方法和给药途径给规定体重的试验动物，观察其急毒反应(是否死亡)，是一个限度试验。 异常毒性试验

3、出现： 主要取决于供试品在生产中是否引入，可发生异常毒性杂质,3)过敏试验 检异性蛋白试验-引起多种过敏反应 轻:皮肤产生红斑/丘疹 过敏 重:窒息、发绀、血管神经性水肿 血压降低、休克、死亡,4)降压物质检查 指药物中含有能导致血压降低的杂质，包括组胺、类组胺或其他物质。 来源：用动物脏器/组织制备时，在正常组织中存在。 方法：猫/狗血压法检药物中所含降压物质,5)无菌检查 对药物及敷料是否染有活菌的检查。 由于许多生化药物不能高温灭菌，故检查此项,4、含量/效价测定 表示方法： (1)含量百分比：适用于化学结构明 确小分子/经水解后变成小分子药物。 (2)生物效价/酶活力单位表示，适于酶类

4、、蛋白质类,常用方法： (1)酶法 (2)电泳法 (3)生物检定法 (4)理化法,1)酶法 酶活力测定法： a.终点法：单酶反应定量法 指示酶反应偶联定量法 b.取样测定法 c.连续测定法 酶分析法： a.动力学分析法 b.总变量分析法,2)电泳法 自由界面电泳法 高效毛细管电泳法 区带电泳法 a.纸电泳法 b.醋酸纤维素薄膜电泳法 c.聚丙烯酰胺凝胶电泳法 d.十二烷基硫酸钠(SDS) 聚丙烯酰胺凝胶电泳法,3)生物检定法 是利用药物对生物体的作用以测定其效价或生物活性的一种方法。 以药物的药理作用为基础，生物统计为工具，运用特定的实验设计，通过供试品和相应的标准品或对照品在一定条件下比较产

5、生特定生物反应的剂量比例，来测得供试品的效价,4)理化法 重量法 a.提取法 b.挥发法 c.沉淀法 测定法 比色法 UV,高效凝胶过滤色谱法 a.分离根据有效粒径 b.分离在固定比例水液中 c.活性蛋白可回收,高效离子交换色谱法 a.分离根据离子化浓度 b.分离盐浓度增大的梯度洗脱法 c.分离在阳/阴离子交换间呈现差异大 d.柱效中等并具高质量的活性回收,三、生化药物分析进展 总体向理化/仪器分析发展 如：GC、HPLC、UV、TR、质谱、磁共振、超离技术、放射免疫、酶试剂、酶电极检测等。 另，应用细胞培养，对生化药的活力和效价检测。 单克隆体免疫分析技术及基因分析技术，提高检测限量和灵敏度

6、,生物检定技术,第一节 微生物限度检查,一、定义,微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。微生物限度检查应在环境洁净度10 000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行，其全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染,二、检查方法,药品微生物限度检查采用活菌计数， 计数方法包括： 平皿法、薄膜过滤法,一、平皿法,1设备、仪器及用具 无菌室、超净工作台、恒温培养箱(室)、匀浆仪、恒温水浴箱、电热干燥箱、冰箱、高压蒸汽灭菌器、菌落计数器 (JLQ-ST或JLQ-S2型)、显微镜 (1500)、天平 (感量0.1g

7、)、锥形瓶、研钵 (直径1012mm)、培养皿 (直径90mm)、量筒、试管及塞子、吸量管 (1mL、10mL)、载玻片、盖玻片、玻璃或搪瓷消毒缸 (带盖)、大橡皮乳头、小橡皮乳头、无菌衣、无菌裤、无菌帽、无菌口罩 (也可用一次性物品替代)、接种环、酒精灯 (乙醇灯)、乙醇棉球、灭菌剪刀及镊子、灭菌称样纸及不锈钢药勺、试管架、火柴、记号笔、白瓷盘、洗手盆等。 玻璃器皿均于160干热灭菌2h或高压蒸汽灭菌12l 20min，烘干备用,一、平皿法,2试剂 稀释剂(pH6.8无菌磷酸盐缓冲液、pH7.6无菌磷酸盐缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲溶液)、聚山梨酯80、无菌斯

8、盘80、单硬脂酸甘油酯、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基 (YPD,一、平皿法,3试验前的准备 无菌室使用前开启紫外灯和空气过滤装置，至少30min；将所需已灭菌或消毒的用品按无菌操作技术要求移至无菌操作室；操作人员按要求穿戴无菌服，进入无菌操作室；操作前，先用乙醇棉球消毒手，再用乙醇棉球擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用无菌的手术剪刀将供试品瓶、盒、袋启封。启封后先仔细检查瓶盖内侧及瓶口周围有无生霉长螨的迹象，对肉眼可见疑似者用放大镜和显微镜观察，若证实为生霉、长螨，即可判定为不合格，无需继续检验。 检验量：一般供试品的检验量为10g或10mL，化学

9、膜剂为100cm2，检验时，应从2 个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂不得少于4片。一般随机抽取不少于检验用量的3倍量供试品,一、平皿法,4药品的预处理 供试液制备若需水浴加温时，温度不超过45，从制备到加入检验用培养基不得超过 1h。 (1) 液体供试液 一般取供试品10mL，加入稀释剂90mL中，充分振摇，即可作为l10供试液；含王浆或蜂蜜的合剂、滴眼剂可以原液作为供试液；油剂可加入适量聚山梨酯80，再照上法制备成供试液；气雾剂可以适宜方法使抛射剂导出后，加入适量稀释剂，混匀，吸取相当于10g或10mL供试品，再稀释至100mL，作为供试液,一、平皿法,4药品的预处理 (2) 固体、半固

10、体或黏稠液供试品 一般取供试品 取10g，置pH7.0无菌氧化钠一蛋白胨缓冲溶液100mL中，用匀浆仪或其他适宜方法，混匀后制备成110供试液。 非水溶性供试品 取供试品5g (5mL)，加入含溶化的无菌斯盘80 5g、单硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯80 10g混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45左右的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液至100mL，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为供试液 (120)。也可以取供试品10g，加至含20mL无菌十四烷酸异丙酯和无菌玻璃珠的适宜容器中，充分振摇，使其溶解，然后加入45左右的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液100mL，振摇510mi

11、n，萃取，静置，取水层作为110供试液。,一、平皿法,4药品的预处理 (2) 固体、半固体或黏稠液供试品 不溶于水的膜剂供试品 取100cm2，剪碎，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液100mL(必要时可增加稀释剂)，浸泡，振摇，作为供试液。 肠溶胶囊(片)供试品 称取供试品10g，置含pH6.8无菌磷酸盐缓冲液100mL的锥形瓶内，于45水浴中，保湿，振摇，使溶解作为供试液,一、平皿法,4药品的预处理 (3) 含抑菌成分供试品 当供试品对控制菌的检查有干扰时，需根据供试品的不同情况，适当地进行处理，以消除抑菌成分的干扰。常用的处理方法有以下几种。 培养基稀释法 将供试液种入较大量的培养基

12、中，使该供试液稀释至不具抑菌作用的浓度。 离心沉淀集菌法 取规定量的供试液，离心(3 000 r/min)30min，弃去上清液，留底部集菌液约2mL，再稀释成原规定量的供试液。如有不溶性药渣，可先离心(500r/min)5min，取全部上层液，再进行集菌处理,一、平皿法,4药品的预处理 (3) 含抑菌成分供试品 当供试品对控制菌的检查有干扰时，需根据供试品的不同情况，适当地进行处理，以消除抑菌成分的干扰。常用的处理方法有以下几种。 薄膜过滤法 取规定量的供试液，置稀释剂100mL中，摇匀，以无菌操作加入装有直径约50mm、孔径不大于0.45m0.02m微孔滤膜的过滤器内，减压抽干后，用稀释剂

13、冲洗滤膜3次，每次50100mL，取出滤膜备检。 中和法 凡含磺胺、汞、砷类或防腐剂的供试品，可用相应的试剂钝化活性因子，中和毒性后制成供试液,一、平皿法,5细菌总数计数 (1) 供试液制备 按各类制剂制备供试液的方法制备成110的供试液。 (2) 稀释(10倍递增稀释法) 取23支灭菌试管，分别加入9mL稀释剂，并取1支1mL灭菌吸量管吸取110均匀供试液1mL，加入已备妥的装有9mL灭菌稀释剂的试管中，混匀即成1100的供试液。以此类推，稀释至 11 000或l10 000,一、平皿法,5细菌总数计数 (3) 吸样 根据供试品污染程度，分别取连续三级10倍稀释的供试液，一般取110、l10

14、0、l1 000三级稀释液检验。每级稀释液用1mL灭菌吸量管吸取稀释液，分别注入23个平皿各1mL。另取1支1mL吸量管吸取稀释剂各1mL注入2个平皿中，作为阴性对照，应不得有菌生长。操作时，应特别注意每次吸液前必须使稀释液充分混匀，以使菌体充分均匀分散，降低测定误差。 (4) 倾注培养基 事先将营养琼脂培养基熔化，冷至低于45时，注入上述各平皿，每皿1520mL，快速转动平皿使稀释液与培养基混匀，放置，待凝,一、平皿法,5细菌总数计数 (5) 培养 将已凝固的平板倒置，放入3035培养箱(室)中，培养48h。 (6) 菌落计数 由于细菌种类繁多，形成的菌落大小、形状、色泽、透明度等皆因种而异

15、，差别甚大。计数时一般用肉眼直接计数、标记或在菌落计数器上点计，必要时借助放大镜或显微镜。不要漏计琼脂层内和平板边缘生长的菌落，并须注意细菌菌落与药渣或培养基的沉淀物、酵母菌及霉菌菌落的区别,一、平皿法,5细菌总数计数 (7) 结果报告 菌数报告：选择菌落数在30300之间的稀释级平板计数，以该稀释级的平均平板菌落数乘稀释倍数作为报告菌数；若邻近的2个稀释级平均平板菌落数均在30300之间，计算级间比值，当比值2时，以2级菌落数的平均值为报告菌落数，比值大于2但不超过5时，按低稀释级平均菌落数乘稀释倍数为报告菌数。当比值大于5时，或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应重新

16、验证；各稀释级平均菌落数均不足30时，以最低稀释级平均菌落数乘稀释倍数为报告菌数；如各稀释级平板均无菌落生长，或仅最低稀释级平均菌落数小于1时，以小于1乘以最低稀释倍数的值为报告菌数,一、平皿法,6霉菌总数及酵母菌总数计数 (1) 培养基、稀释剂 培养基 玫瑰红钠琼脂培养基，酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基 (YPD)。该培养基更适合于酵母菌生长，故中国药典规定含有王浆、蜂蜜的合剂用它测定酵母菌数。 稀释剂 0.9%无菌氯化钠溶液，pH6.8磷酸盐缓冲液,一、平皿法,6霉菌总数及酵母菌总数计数 (2) 操作方法 霉菌和酵母菌数测定一般与细菌数测定同时进行，按规定取2个以上包装的供试品。 供试液制备

17、 按各类制剂制备供试液的方法制备成110的供试液。 稀释(10倍递增稀释法) 取23支灭菌试管，分别加入9mL稀释剂，并取1支1mL灭菌吸量管吸取110均匀供试液1mL，加入已备妥的装有9mL灭菌稀释剂的试管中，混匀即成1100的供试液。以此类推，稀释至 l1 000或110 000,一、平皿法,6霉菌总数及酵母菌总数计数 (2) 操作方法 霉菌和酵母菌数测定一般与细菌数测定同时进行，按规定取2个以上包装的供试品。 吸样 根据供试品污染程度，分别取连续3级10倍稀释的供试液，一般取110、1100、11 000 3级稀释液检验。每级稀释液用1mL灭菌吸量管吸取稀释液，分别注入23个平皿各1mL

18、。另取1支1mL吸量管吸取稀释剂各1mL注入2个平皿中，作为阴性对照，应不得有菌生长。操作时，应特别注意每次吸液前必须使稀释液充分混匀，以使菌体充分均匀分散，降低测定误差,一、平皿法,6霉菌总数及酵母菌总数计数 (2) 操作方法 霉菌和酵母菌数测定一般与细菌数测定同时进行，按规定取2个以上包装的供试品。 倾注培养基 事先将玫瑰红钠培养基熔化，冷至低于45时，注入上述各平皿。每皿约1520mL，含王浆、蜂蜜的合剂另做一套平板，倾注酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，快速转动平皿使稀释液与培养基混匀，放置，待凝。 培养 将已凝固的平板倒置，放入2328培养箱(室)中，培养72h，必要时可适当延长时间至5

19、7天,一、平皿法,6霉菌总数及酵母菌总数计数 (2) 操作方法 霉菌和酵母菌数测定一般与细菌数测定同时进行，按规定取2个以上包装的供试品。 菌落计数 一般在平板背面用肉眼直接点数，必要时用放大镜检查，以防遗漏。固体制剂在玫瑰红钠琼脂平板上点计霉菌菌落数，液体制剂在玫瑰红钠琼脂平板上同时点计霉菌菌落数及酵母菌菌落数，含王浆或蜂蜜的合剂须以玫瑰红钠平板的霉菌菌落数加上酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂平板上的酵母菌菌落数作为供试品的霉菌和酵母菌总数,一、平皿法,6霉菌总数及酵母菌总数计数 (2) 操作方法 霉菌和酵母菌数测定一般与细菌数测定同时进行，按规定取2个以上包装的供试品。 菌数报告 选择菌落数在301

20、00之间的稀释级平板计数，以该稀释级的平均平板菌落数乘稀释倍数作为报告菌数；若邻近的2个稀释级平均平板菌落数均在30100之间，计算级间比值。当比值2时，以2级菌落数的平均值为报告菌落数；比值大于2但不超过5时，按低稀释级平均菌落数乘稀释倍数报告菌数；当比值大于5时，或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应重新验证；各稀释级平均菌落数均不足30时，以最低稀释级平均菌落数乘稀释倍数为报告菌数；如各稀释级平板均无菌落生长，或仅最低稀释级平均菌落数小于l时，以小于1乘以最低稀释倍数的值为报告菌数,一、平皿法,6霉菌总数及酵母菌总数计数 (2) 操作方法 霉菌和酵母菌数测定一般与细

21、菌数测定同时进行，按规定取2个以上包装的供试品。 复试 供试品检测霉菌 (酵母菌) 数不合格的，应从同一批号样品中随机双倍量抽 样，平行复试2次，取3次测定数据的算术平均值报告。眼科用药的霉菌和酵母菌菌落数复试报告，须以2次复试结果均不得长菌，方可判为供试品合格,一、平皿法,7原始记录（详见附录四,二、薄膜过滤法,采用薄膜过滤法，滤膜孔径不大于0.45m、直径约50mm，水溶性供试液过滤前将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜；油类供试品，其滤膜和过滤器在使用前应充分干燥。过滤后，若需用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100mL,二、薄膜过滤法,取相当于每张滤膜含1g或1mL供试品的供试液，加至适量

22、的稀释剂中，混匀过滤，若供试品每lg或1mL所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液1mL过滤。用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液冲洗滤膜，冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备1张滤膜,二、薄膜过滤法,阴性对照试验：取试验用的稀释液1mL，按照上述滤膜过滤法操作，作为阴性对照，阴性对照不得长菌。 培养和计数：培养条件和计数方法同平皿法，每片滤膜上的菌落数应不超过100个。 菌数报告规则：以相当于1g或1mL供试品的菌落报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以小于1报告菌数(每张滤膜过滤1g或1mL供试品)，或小于

23、1乘以稀释倍数的值报告菌数,生物检定技术,第二节 无菌检查,无菌检查法系用于检查中国药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、敷料及其他品种是否无菌的一种方法。无菌检查法应在环境洁净度10 000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染,1仪器与用具,1) 仪器 恒温培养箱(室)或生化培养箱、高压蒸汽灭菌器、电热恒温干燥箱、生物学显微镜。 (2) 灭菌器材 玻璃器皿：试管、锥形瓶、量筒、量杯、载玻片、刻度吸管 (1mL，2mL，5mL，10mL)、注射器注(2mL，5mL，10mL)、培养皿 (直径90mm)、输液瓶、酒精灯等。 手术剪

24、刀、镊子、注射器针头 (9号，12号，16号)、接种针(环)、白金耳、橡皮塞、橡皮管、纱布、棉花 (制棉塞、堵吸管及无菌试验均用原棉不用脱脂棉)、脱脂棉 (消毒棉球用)、乳胶手套等。 无菌衣、裤、帽、罩、鞋。 开放式滤器、微孔滤膜 (直径50mm，孔径0.45m)。 (3) 消毒器材,2试剂,1) 消毒剂 0.2%苯扎溴铵溶液、75%乙醇溶液 (制酒精棉球用)、3%5%甲酚溶液、5%甲醛、0 1%高锰酸钾等。 (2) 稀释剂 0.1%蛋白胨水溶液、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液。 (3) 灭活剂 无菌青霉素酶溶液。 (4) 染色剂 革兰染色液。 (5) 蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、磷酸氢二

25、钾、磷酸二氢钾、氯化钠、硫酸镁、L-胱氨酸、硫乙醇酸钠(或硫乙醇酸)、胰酶水解酪胨、刃天青 (或亚甲蓝)、琼脂、2moL/L盐酸溶液、2moL/L氢氧化钠溶液等,3培养基及培养基适用性检查,1) 菌种 中国药典2005年版规定培养基灵敏度所用菌株传代次数不得超过5代 (从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代)。 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcs aureus) CMCC(B)26003 铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aerginosa) CMCC (B)10104 枯草芽孢杆菌 (Bacills subtilis) CMCC (B)63501 生孢梭菌 (Clostri

26、dim sporogenes) CMCC (B)64941 白色念珠菌 (Candida albicans) CMCC (F)98001 黑曲霉 (Aspergillus niger) CMCC（F）98003,3培养基及培养基适用性检查,2) 培养基的配制 好氧菌、厌氧菌培养基(硫乙醇酸盐流体培养基) 培养基配方 酪胨(胰酶水解)15.0g、葡萄糖5.0g、L-胱氨酸0.5g、硫乙醇酸钠0.5g (或硫乙醇酸0.3mL)、酵母浸出粉5.0g、氯化钠2.5g、新配制的0.1%刃天青溶液1.0mL、琼脂0.75g、蒸馏水1 000mL。 配制方法 除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解

27、后，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH使灭菌后为7.10.2，分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层的颜色 (粉红色) 不得超过培养基深度约1/2，灭菌。在供试品接种前，培养基指示剂氧化层的高度不得超过培养基深度约l/5，否则，须经100水浴加热至粉红色消失 (不超过20min)，迅速冷却，只限加热1次，并应防止被污染。 硫乙醇酸盐流体培养基置3035培养,3培养基及培养基适用性检查,2) 培养基的配制 改良马丁培养基(用于培养真菌) 培养基配方 胨5.0g、酵母浸出粉2.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氯二钾1.0g、硫酸铁0.5

28、g、水l 000mL。 配制方法 除葡萄糖外，取上述成分加入蒸馏水内，微温溶解后，调节pH约为6.8，煮沸，加葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调节pH使灭菌后为6.40.2，分装，灭菌。改良马丁培养基置2328：培养,3培养基及培养基适用性检查,2) 培养基的配制 选择性培养基 按上述硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基的处方及制法，在培养基灭菌或使用前加入适量的中和剂或表面活性剂，如对氨基苯甲酸(用于磺胺类供试品)、聚山梨酯80 (用于非水溶性供试品) 或-内酰胺酶 (用于-内酰胺酶类供试品) 等。中和剂或表面活性剂的用量应通过验证,3培养基及培养基适用性检查,2) 培养基的配制 营养肉汤培养基

29、取10.0g胨、5.0g氯化钠、牛肉浸出粉3.0g、水1 000mL混合，微温溶解后，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，调节pH使灭菌后为7.20.2，分装，灭菌。 营养琼脂培养基 按上述培养基的处方及制法，加入14.0g琼脂，调节pH使灭菌后为7.20.2，分装，灭菌，趁热斜放使凝固成斜面,3培养基及培养基适用性检查,2) 培养基的配制 上述培养基分别按15mL与40mL或需要量分装于试管或其他容器中，装量约为试管或容器高度的2/5，以免灭菌时溢出。培养基制备时，均以116灭菌40min。制备好的培养基应保存在225、避光的环境。培养基若保存于非密闭容器中，一般在3周内使用；若保存于密闭容器中，

30、一般可在1年内使用,3培养基及培养基适用性检查,3) 培养基适用性检查 无菌性检查 制备好的每批培养基随机取不少于5支(瓶)，培养14天，应无菌生长。 灵敏度检查 制备好的培养基按规定接入小于l00CFU/mL (菌落形成单位) 的菌悬液，培养后，空白对照管应无菌生长，加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定,4阳性对照试验及阴性对照试验,1) 阳性对照试验 中国药典2005年版规定无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品以生孢梭菌为对照菌；抗真菌的供试品以白色念珠菌为对照菌，加菌量小于100

31、 CFU。阳性对照管培养基4872h应生长良好。 (2) 阴性对照试验 进行供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释液同法操作，作为阴性对照，不得有菌生长,5操作前准备,1) 无菌室消毒，操作人员用肥皂刷洗双手，进入缓冲间换消毒拖鞋，用消毒剂洗双手，用消毒巾擦干，换上无菌衣、裤、帽子、口罩，戴乳胶手套等。在操作过程中要用75%酒精擦手套。 (2) 凡放到超净工作台上的物品，如灭过菌的用具、取样用盒子、培养基、样品等外面均先用消毒剂擦拭，然后再打开超净工作台上的紫外灯。紫外灯开到45min时打开层流，当紫外灯开够1h，关闭超净工作台和缓冲间的紫外灯,5操作前准备,3) 进入无菌室的物品、用具，需经高

32、压蒸汽灭菌，不能用高压蒸汽灭菌的，需用消毒液擦拭其外部，由传递窗递入无菌室。 (4) 洗涤物品、用具。消毒无菌检查的供试品容器外部,6检查方法,1) 薄膜过滤法 过滤 按规定量取供试品，按该样品项下规定的方法处理后，对于无菌粉针剂和粉末原料应用稀释剂溶解到至少100mL具塞的瓶中，混匀。用灭菌刻度吸管注入或直接倒入装有孔径0.45m、直径约50mm滤膜的无菌过滤器，抽干，使药液中的微生物截留在滤膜上。 冲洗 用冲洗液或其他适宜的溶剂冲洗滤膜多次，以洗去抗菌物质。每张滤膜每次冲洗量为100mL，且冲洗量不宜过大,6检查方法,1) 薄膜过滤法 接种培养 将好氧菌、厌氧菌培养基，真菌培养基及阳性对照

33、用培养基分别加至薄膜过滤器内(封闭式过滤器)；或取出薄膜分成3等份，分别加入好氧菌、厌氧菌培养基，真菌培养基及阳性对照用培养基中，好氧菌、厌氧菌培养基管置3035，真菌培养基管置2328，培养14天，在培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。阳性对照管应根据供试品特性加人相应对照菌液1mL (抗细菌药物加入金黄色葡萄球菌对照菌液，抗厌氧菌药物加入生孢梭菌对照菌液，抗真菌药物加入白色念球菌对照菌液)，阳性对照管细菌应在3035培养48h，真菌应在2328培养72h，有菌生长,6检查方法,2) 直接接种法 供试品的制备 供试品如为注射液、供角膜穿通伤及手术用的滴眼剂或灭菌溶液，按规定量取供试品，混合

34、。 供试品如为注射用无菌冻干品或供直接分装成注射用的无菌粉末原料，按规定量取供试品，加入稀释掖，或该药品项下规定的溶剂用量制成一定浓度的供试品溶液,6检查方法,2) 直接接种法 供试品的制备 供试品如为外科敷料，取供试品4个包装，以无菌操作拆开包装，于不同部位分别剪取约100mg或lcm3cm的供试品11份。 供试品如为肠线、缝合线，取最小包装5个，拆开包装，共取11股，接种于足以浸泡没供试品的适量培养基中,6检查方法,2) 直接接种法 供试品的制备 供试品如为灭菌医用器具，依据样品大小、形状的不同，取供试品11个，接种于足以浸没供试品的适量培养基中(或用稀释液各40mL，分别冲洗内壁，收集各

35、种洗液，混合，按薄膜过滤法检查)。 供试品如为青霉素类药品，接规定量取供试品，分别加入足够使青霉素灭活的无菌青霉素酶溶液适量，摇匀，混合(亦可按薄膜过滤法检查,6检查方法,检查方法 取上述备好的供试品，以无菌操作将供试品分别接种2mL于6管好氧菌、厌氧菌培养基，其中1管接种金黄色葡萄球菌对照用菌液1mL作阳性对照，另接种于真菌培养基5管。轻轻摇动，使供试品与培养基混合。好氧菌、厌氧菌培养基管置3035，真菌培养基管置2328，培养14天，在培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。阳性对照管在24h应有菌生长。如果在加入供试品后培养基出现浑浊，培养14天后不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养

36、液适量转种在同种新鲜培养基中或斜面培养基上，继续培养，细菌培养2天，真菌培养3天，观察是否再出现浑浊或斜面上有无菌生长，或用接种环蘸取培养液涂片，染色，用显微镜观察是否有菌,7无菌检验结果判断及报告,中国药典(2005年版) 的无菌检查结果判断。在培养期结束后，当阳性对照管显浑浊并确有菌生长，阴性对照管澄清时才可根据观察所得结果判定如下。 第一次检查结果供试品的好氧菌、厌氧菌培养基管及真菌培养基管均为澄清或虽显浑浊但经检查证明无菌生长，均判为供试品无菌检查合格。 第一次检查结果供试品的好氧菌、厌氧菌培养基管及真菌培养基管中任何一管显浑浊时，取生长管的培养物转种营养琼脂或真菌培养基斜面培养，取菌

37、苔或培养物，经革兰染色、镜检，确证有菌生长，应重新取样进行复试,7无菌检验结果判断及报告,复试时，取同量供试品，依法重试，复试结果除阳性对照管外，其他各管均无菌生长，判供试品检查合格；复试结果其中任一培养基管有菌生长，应判供试品无菌检查不合格。复试时需同时做阴性试验。阴性试验只是不加样品，一切操作与检查样品相同。如果阴性试验培养管中有菌生长表示操作中无菌操作有过失，检验结果无效，并且可以重新复试,7无菌检验结果判断及报告,当符合下列至少一个条件时，方可判实验结果无效。 无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求。 回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素。 阴性

38、对照管有菌生长。 供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和(或)无菌操作不当引起的。试验若经确认无效，应重试,8原始记录,详见附录五,生物检定技术,第三节 热原检查,热原检查法一般采用家兔升温法，系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观测家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定的方法。家兔被注射一定量的热原后，一般1530min体温开始上升，70120min达到最高峰。如果注射规定量的供试品后，家兔没有升温或升温不多，说明供试品内热原含量极少，没有超出许可范围；反之，如果注射供试品后，家兔的升温比较明显，即超出了规定的范围，说明供试品

39、内热原量较大，用于临床后会产生不良反应,一、仪器、用具、试剂的准备,1仪器、用具、试剂 家兔升温法中所需的仪器、用具和试剂有：分析天平 (万分之一)、热原测试仪、电热 干燥箱 (带自动控温装置，最高温度应达300)、超净工作台、恒温水浴 (38)；时钟、煮锅、金属饭盒、金属吸管筒、台秤、兔固定器、肛门温度计或测温仪、注射器 (2mL，5mL，l0mL，20mL，30mL)、注射针头 (6号、7号)、吸量管 (1mL，2mL，5mL，10mL)、称量瓶 (30mm60mm)和广口瓶（100mL，250mL)；75%酒精棉、甘油 (或凡士林)、2%碳酸氢钠溶液、注射用水、氯化钠注射液,一、仪器、用

40、具、试剂的准备,2用具的清洗和热原的除去 (1) 用具的清洗 玻璃用具用自来水冲洗浮尘后，放入去污剂溶液中浸泡30min以上，取出后用自来水 冲洗干净，再用蒸馏水冲洗3遍。注射针头用自来水冲洗后，在2%碳酸氢钠溶液中煮沸15min后，用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗3遍。 (2) 用具的除热原 将清洗干净的注射器、称量瓶、玻璃小瓶、注射针头等置于金属盒 (或锡箔纸) 内，将吸量管置于金属筒 (或锡箔纸)内，放入电热干燥箱内，升温至250，保温0.5h。 (3) 温度计的校正 测量家兔体温应使用精密度为0.1的测温装置,二、家兔的挑选与准备,1家兔的挑选 (1) 选择健康无伤，体重为1.73.0

41、kg的家兔，雌兔应未孕。测前7天用同一饲料饲养，在此期间，家兔无体重减轻、精神、食欲、排泄等异常现象。 (2) 试前37天内预测体温，每半小时一次，共8次，体温在3839.6之间，高低 温差小于0.4的家兔可用。上次用于检查为阴性的家兔，休息2天可用，不需选择。升温达0.6的家兔，仍按上法挑选。 (3) 每一批家兔使用次数，用于一般药品的检查，不超过10次,二、家兔的挑选与准备,2检查前的准备 查前12天内，供试家兔应在与实验室相同温度的饲养室饲养，二者温差不大于5.0。实验室室温在1725，试验全过程，室温差小于3。此外实验室要安静。试验前参加试验的家兔停食lh以上,三、检查操作方法,1供试

42、品溶液的制备 (1) 如供试品为原料药，则精密称定适量，根据其效价或含量计算加水量，稀释至所需浓度。 (2) 如供试品为制剂，按标示量计算加水量，稀释至所需浓度。 (3) 如供试品溶液注射剂量3mL/kg，应在注射前预热至38。 (4) 供试品溶液的制备，应在超净工作台内进行；除另有规定外，试验用水均指灭菌用水,三、检查操作方法,2家兔体温的测量 (1) 家兔的固定 左手抓住家兔的双耳，右手托住家兔的尾部，从饲养笼放到台秤上称重，并把体重记在兔卡上，而后放入固定器中固定。 (2) 探头固定 轻轻提起兔尾，把蘸有甘油 (或凡士林) 的测温仪探头轻轻插入肛门约6cm深，再把兔尾和探头固定在一起，避

43、免探头脱落，直到试验完毕,三、检查操作方法,2家兔体温的测量 (3) 体温预测 家兔置于固定器中至少休息lh后，开始测量第1次体温，隔30min测第2次体温。两次体温相差不超过0.2为符合要求，并以两次体温的平均值作为该兔的正常体温。当日使用的家兔体温应在38.039.6范围内，且所有家兔体温之差不得超过1。测量温度的方式有两种：一种使用热原测温仪，按操作程序即可；另一种用肛门温度计，测温时插入肛门的时间不少于1.5min,3供试品溶液的注射,经测定，家兔体温符合要求后15min内，进行耳静脉注射。每批供试品注射家兔的数量为初试3只，复试5只。 注射前先用75%酒精棉擦耳朵边缘，用小镊子将除热

44、原的注射器和针头套好，按规定剂量抽取温热至约38的供试品溶液，由耳静脉徐徐注入。注射完后用手捏紧针眼处数秒钟，以助止血,4注射后家兔体温的测量,注射后，每隔30min测量体温1次，共测6次。以6次中体温最高1次减去注射前的正常体温，即为该兔体温的升高度数。如3只家兔中有1只体温升高0.6或0.6以上，或3只家兔体温升高均低于0.6，但体温升高的总和达1.4或1.4以上，应另取5只家兔复试，检查方法同上,5结果判断,1) 供试品热原检查合格 初试3只家兔中，升温均小于0.6，总升温数小于1.4； 或复试5只家兔中，体温升高大于或等于0.6者不超过1只，且初试、复试8只家兔的升温总数小于或等于3.

45、5时，均可判断供试品热原检查合格。 (2) 供试品热原检查不合格 初试3只中，体温升高大于或等于0.6超过1只，或复 试的5只中，升温大于或等于0.6的家兔超过1只，或初试、复试8只家兔的升温总数大于3.5时，均判断供试品热原检查不合格。当家兔升温为负值时，均以0计,6原始记录,详见附录六、附录七,生物检定技术,第四节 降压物质检查,本法系比较组胺对照品与供试品引起麻醉猫血压下降的程度，以判定供试品中所含降压物质的限度是否符合规定,l仪器与用具,自动平衡记录仪、分析天平 (十万分之一)、电冰箱、直形剪刀、弯形剪刀、止血钳、镊子、眼科直形小镊子、弯头小镊子、弯头小剪刀、手术缝合针、注射器 (1m

46、L，2mL，5mL，10mL)、注射针头 (5号，9号)、A类吸量管 (1mL，2mL，10mL)、具塞试管 (25mL，50mL)、烧杯 (100mL)、双向活塞管、量杯 (100mL)、脱脂棉、纱布、线绳、乳胶管、动静脉插管、手术缝合线等,2试剂,垂体后叶标准品、10%戊巴比妥钠溶液 (临用时用注射用水新鲜配制)、注射用水、氯化钠注射液、乌拉坦溶液、肝素钠 (12 500U/2mL)、0.5g/mL的磷酸组胺对照品溶液(临用时新鲜配制,3试验动物,降压物质检查用猫应毛色光滑，眼睛有神，无病症，鼻孔无黏液，肛门清洁干燥，皮下无肿块，动作敏捷，体重2.0kg以上，雌雄均可，雌猫无孕,4检定用溶

47、液,1) 组胺对照品溶液的配制 用十万分之一天平精密称取磷酸组胺对照品25mg左右，按组胺计算加注射用水溶解使成每1mL中含1.0mg的溶液，分装于小瓶中，48避光贮存，如无沉淀析出，可在3个月内使用。临用前，用氧化钠注射液稀释成0.5g/mL的溶液。 (2) 降压物质供试品溶液的配制 按各药品标准项下规定的剂量，用氯化钠注射液配 成适当浓度的供试品溶液。如供试品为原料药，则精密称定适量，按效价或含量计算加水量。如供试品为制剂，按标示量计算加水量，稀释至适当浓度,5降压物质检查法,1) 手术前的准备 将静脉插管用乳胶管与灌满氯化钠注射液的双向活塞装置连接 好，并排除气泡；将动脉插管用三通与灌有

48、1/2氯化钠注射液的制压瓶和信号转换装置连接好，排除气泡；制压瓶保持一定压力；准备好自动平衡记录仪 (或多导生理仪)；接通电源开启记录仪，检查运行是否正常。 (2) 猫的麻醉 把猫放入布袋内称重，按体重计算麻醉剂(戊巴比妥钠)剂量(4045mg/kg)， 用10%戊巴比妥钠溶液按1mL/kg进行腹腔注射，将麻醉好的猫，仰卧于保温手术台上并固定好,5降压物质检查法,3) 动脉、静脉的分离与插管 股静脉的分离与插管 用弯形剪刀剪干净手术部位的毛，用镊子将近膝部、股内侧的皮肤剪开，分离出一侧股静脉，剪一小口，插入静脉插管、扎紧并固定于猫腿上。推入一定量的氯化钠注射液，如其畅通无漏水即可。 动脉的分离

49、与插管 用手术弯形剪刀剪去颈部毛，再用镊子将咽部皮肤提起，用剪刀沿中线自甲状软骨下方剪至胸骨上缘，在胸锁乳突肌与颈阔肌之间分离出一侧颈动脉后，再把与动脉相连的神经分开，剪口插入动脉管，扎紧并固定好，将动脉插管与记录仪之间的螺旋夹打开，打开记录仪观察走纸，检查结扎是否严密，走纸不下滑即可。 血压记录 往动脉插管注入0.30.5mL肝素钠溶液，缓慢打开动脉夹，记录血压,5降压物质检查法,4) 供试品的检查 灵敏度测定 打开动脉夹后，观察猫的血压。待血压稳定后，从股静脉注入第一组组胺对照品，分别按每千克体重0.05g，0.10g，0.15g三个剂量注射，每次注入后均以56mL氯化钠注射液送入。相邻两针间隔应一致 (不少于35min)，并应在前一针反应恢复后再进行下一针注射。如此重复23组。如果0.10g/kg的剂量所致血压下降均超过2.67kPa，同时相应各剂量所致反应的平均值有差别，则认为该猫的灵敏度符合规定。 供试品溶液测定 待猫的血压恢复稳定后，开始供试品的测定，依次注射组胺对照品(ds) 0.1g/kg和供试品溶液(d)(调节两者溶液的浓度，使注入的体积一致)。4针的顺序为d