次：体外培养物的生长生物学1.ppt

1、体外培养的原理与技术 薛庆善 主编,广西医科大学组胚教研室 何少健,电话0771-5358577(办) E-mail: ,我的细胞培养计划 （手写和打印均可,应包括如下内容： 1、培养目的： 2、实验室条件：已具备的条件；尚未具备的条件。 3、培养方法： 1）培养基的选用（含应补充的附加成分）及培养所需的其它用液； 2）具体操作方法及步骤（按实际操作分步列出）； 3）培养过程的观察的注意事项； 4、目的细胞的鉴定方法： 1）具体方法（可列13种）； 2）应出现的结果：阳性；阴性。 5、困难及解决办法,本课程的作业及考核依据之一,我的细胞培养计划 （手写和打印均可,注意

2、事项： 1、作业上交时间及地点： 时间：校历第16周（08.12.19）前 地点：104馆三楼（组胚教研室） 2、作业必须标明的项目： 题 目 学号 姓名 专业 导师,本课程的作业及考核依据之一,体外培养的基本原理与技术,一、从体内生存环境到体外生长条件,二、体外培养的基本方法和过程,三、体外培养物的生长生物学,四、细胞分离与纯化,五、细胞系（株）、细胞克隆,六、培养物的观察检测方法,体外培养有机体的结构成分，其生长生物学特征具有两重性： 一方面，培养物取自于体内，它的基本生物学特征仍与体内的细胞相似，乃所谓“万变不离其宗”。 另一方面，培养物在体外条件下生长，生长环境与体内相比有很大差异，尤

3、其是失去了在体时有机体整体的生长调节机制，因而培养物的许多生长生物学行为将会发生改变，此即为“入乡随俗”。 分析和评价体外培养的结果需同时考虑到此两方面的特征，既不能生搬硬套在体细胞的生物学规律，也不要完全否认培养物的生长生物学行为与体内的一致性,体外培养物的生长生物学,体外培养物的生长生物学,二、体外培养物的细胞生物学特点,三、影响动物细胞体外生长的因素,一、体外细胞培养物的生长类型,一、体外细胞培养物的生长类型,按照体外培养的结构成分可将培养的类型分为组织培养、细胞培养、器官培养以及整体培养等。 下面讨论的主要是细胞培养时的情况,体外培养的细胞，按照其生长方式大体可分为黏附型和悬浮型两大类

4、。 黏附型细胞是必须附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。 悬浮型细胞则是不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。 绝大多数有机体细胞属于黏附型细胞，只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞以及有些微生物可在悬浮状态下生长,一）黏附型细胞,黏附(adherence)是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式。 黏附有两方面含义：其一是细胞与细胞之间相互接触；其二是细胞与细胞外基质结合,当细胞被放到体外环境中以后，需要黏附于某一固相表面才能生存和生长，因而属于黏附型细胞。 其中有一些细胞类型惟有黏附于固相表面才能生存，这样的细胞被称为黏附（锚定或锚着）依赖型（性）细胞（

5、anchorage-dependent cell,一、体外细胞培养物的生长类型,由于体内、外生长环境不同，故细胞在体内、外的黏附方式也存在差异。 在体内，细胞的黏附是全方位的，细胞的各个部分都与周围环境相接触，因而细胞外形具有复杂的立体特征。 当细胞被转移到体外环境中之后，能够提供附着面的只有培养器皿的壁，大多数情况下，细胞只有一个附着平面，因而培养细胞的外形一般与在体时明显不同,一）黏附型细胞,一、体外细胞培养物的生长类型,按照培养细胞的主要形态，可将其分为几大类型,上皮型细胞,成纤维细胞型细胞,游走型细胞,多形型细胞,一）黏附型细胞,一、体外细胞培养物的生长类型,上皮型细胞,体外培养中的上

6、皮型细胞泛指那些外形上类似上皮细胞，大体为扁平样的多种培养细胞,这类培养细胞的主要形态学特征是： 扁平，形态较为规整，细胞大致呈多角形，胞体近中央处有扁圆的细胞核；细胞之间相互衔接或呈镶嵌状紧密排列；当细胞紧密排列时，细胞可为六角形或多角形，因为相互拥挤而呈现“铺路石样”，局部可构成单层的上皮样“膜片组织,一）黏附型细胞,一、体外细胞培养物的生长类型,培养的上皮型细胞,成纤维细胞型细胞,成纤维细胞型的细胞外形与体内成纤维细胞形状相似，胞体大致呈梭形或不规则形。 这类培养细胞的主要形态学特征是： 细胞呈梭形、长条形、多角形或不规则形，后两种情况下常具宽扁胞质突起（片状伪足）；胞质近中央处有椭圆形

7、胞核，胞体一般铺展很开。多数情况下，细胞之间排列疏松，有较大细胞间隙。有时也见相互平行排列，成群细胞呈现放射状、漩涡状等走行形式,一）黏附型细胞,一、体外细胞培养物的生长类型,培养的成纤维细胞型细胞,游走型细胞,体外培养中的游走型细胞具有类似巨噬细胞样的特征。 其形态学特征是： 细胞相互分散，一般不形成群落；细胞内易出现色暗的吞噬性颗粒，常具有胞质突起（伪足）。 这类细胞在培养器皿壁上生长的位置不固定，经常处于较活跃的变形及游走状态，因此外形不规则且不断变化。 当细胞密度增大相互连接成片时，游走受限，形状上类似上皮型细胞或成纤维细胞型的细胞,一）黏附型细胞,一、体外细胞培养物的生长类型,多形型

8、细胞是一些形态上不规则的细胞，不规则形态由宽扁的胞质突起所致。 其细胞一般分胞体和胞突两部分。胞突为细长形，似丝状伪足。胞体虽略呈多角形，但没有成纤维细胞型那样不规则。 体外培养中呈现多形型的细胞最常见的类型是神经元和神经胶质细胞,多形型细胞,一）黏附型细胞,一、体外细胞培养物的生长类型,培养中的星形胶质细胞 （8d,星形胶质细胞,培养中的星形胶质细胞 （传1代,培养中的星形胶质细胞 （传2代,星形胶质细胞（传3代） （GFAP标记免疫荧光,上述四种形态学类型是培养细胞的常见形式，也是较为明显的几种形态学形式。 然而，许多情况下，所培养的细胞并不一定呈现典型的形态形式，而出现一些过渡形态,能够

9、影响细胞形态学特征的主要因素包括血清成分、培养液中的添加成分、培养液的酸碱度、气相环境、温度条件等。例如，许多已分化的细胞，在有血清培养液中生长或者在无血清培养液中生长，形态上就有差异,一）黏附型细胞,一、体外细胞培养物的生长类型,二、悬浮型细胞,这类细胞的生命活动不需要固相支持物。其主要形态学特点是胞体始终为球形。 能以悬浮状态生长的细胞，密度一般都可以较大，故培养的效率高。 以这种方式培养细胞时，转换培养液、补加培养液以及收获细胞都比较容易。 不足之处是不方便观察,一、体外细胞培养物的生长类型,二、体外培养物的细胞生物学特点,体外培养物的细胞生物学特性与其在体内生长时到底有哪些差别？这是运

10、用体外培养这门技术研究生命科学和从事生产实践活动首先要了解和掌握的问题,一）培养细胞分化状态的变化,二）培养细胞的增殖能力,三）体外培养细胞的生长过程,四）体外培养细胞的形态学,五）植块培养物的生长生物学,一）培养细胞分化状态的变化,由受精卵通过细胞增生与分化产生原始的胚层结构，再由后者进一步分化、发育和衍生出体内各种各样的细胞及体内组织器官，这是脊椎动物胚胎发育的基本过程。 在以后的生长发育过程中，体内每一个细胞都将始终受到三方面的影响与调节，即来自体外环境的影响、体内神经一体液因素的调节以及细胞与局部微环境的相互作用。这些因素控制着体内细胞的增殖活动、代谢和功能状态，维持着细胞的分化特征,

11、二、体外培养物的细胞生物学特点,当有机体的细胞被置于体外环境中培养时，主要的体内调节因素丧失，细胞所面临的基本生活环境就是培养液以及大为减弱的相邻细胞间的相互作用。 失去了体内多方面调节因素的压力，细胞随即转向“自由”生长状态。 增殖约束逐渐取消，分化特征逐渐减弱，原本各种各样的分化细胞，逐渐失去各自的形态与功能“个性”，表现出某种趋同性，这种现象被称为去分化或脱分化（dedifferentiation,一）培养细胞分化状态的变化,二、体外培养物的细胞生物学特点,相反，低密度生长、低Ca2+浓度（仅100600 mol/L）以及有细胞生长因子的存在（如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板来

12、源的生长因子等），有利于细胞增殖，不利于细胞分化,根据实验目的的不同，有时为了防止培养细胞“自主”去分化，可以采取某些措施，如在培养时： * 提高接种的细胞密度（高于105个cm2）； * 提高Ca2+浓度（至3001500 mol/L）； * 使用诱导分化的激素与或生长因子,一）培养细胞分化状态的变化,二、体外培养物的细胞生物学特点,二）培养细胞的增殖能力,分裂增殖和生长发育（后者包含分化）是体外培养细胞的两大生命特征。 大多数类型的有机体细胞在培养过程中能始终保持有丝分裂的能力。培养中的细胞只要生长空间许可，就会发生分裂增殖。只有当增殖生长至相互紧密接触成片时，便发生所谓的“接触抑制”现象

13、而停止增殖,二、体外培养物的细胞生物学特点,培养细胞的增殖能力一般与该种细胞在体内的增殖能力相仿。 胚胎组织细胞相对于成年组织细胞，体外生长时更易增殖和生长。例如,二、体外培养物的细胞生物学特点,体外培养的人胚成纤维细胞可连续经历150300个增殖周期，不间断地反复传代达3050代，最后衰老死亡，寿命约为一年,二）培养细胞的增殖能力,大多数分化程度较高的细胞，如上皮源性的细胞，在体外培养时仅能传代几次或10余次。其原因：除了胚胎细胞本身的生命力比成年组织细胞旺盛外，还有一个可能就是，胚胎组织内存在分化水平较低的、可增殖的前体细胞或者胚胎干细胞,培养细胞的增殖能力一般与该种细胞在体内的增殖能力相

14、仿。 胚胎组织细胞相对于成年组织细胞，体外生长时更易增殖和生长。例如,二、体外培养物的细胞生物学特点,二）培养细胞的增殖能力,高度分化的有丝分裂后细胞如神经元和肌肉细胞，体外培养时的生长繁殖能力与其在体内时相似，除了来自早期胚胎的材料尚能进行很有限的数次分裂外，一般没有分裂增殖能力，体外培养这些细胞仅能表现一定程度的生长发育现象，通常不进行传代,培养细胞的增殖能力一般与该种细胞在体内的增殖能力相仿。 胚胎组织细胞相对于成年组织细胞，体外生长时更易增殖和生长。例如,二、体外培养物的细胞生物学特点,二）培养细胞的增殖能力,只有那些获得永生性（或称不死性）的肿瘤细胞才可以在体外几乎无期限地传代下去,

15、培养细胞的增殖能力一般与该种细胞在体内的增殖能力相仿。 胚胎组织细胞相对于成年组织细胞，体外生长时更易增殖和生长。例如,二、体外培养物的细胞生物学特点,二）培养细胞的增殖能力,三）体外培养细胞的生长过程,从体外培养的总的过程来看，体外培养细胞的整个生命活动可分为三个时期： 1、原（初）代培养期 2、传（继）代培养期 3、衰退期,二、体外培养物的细胞生物学特点,1、原代培养期,原（初）代培养期是指从体内取出组织细胞开始培养到第一次进行传代之前的这一段时期。 一般为14周,由于体外培养中的“传代”并没有与细胞周期的长短确切相关，传不传代及何时传代与原代培养接种的细胞数量、培养瓶皿的大小以及培养条件

16、密切相关，在一定程度上具有可人为操作的特征,三）体外培养细胞的生长过程,二、体外培养物的细胞生物学特点,原代培养期内，培养物的细胞成分是混杂的，即呈现异质性（heterogene），除了目的细胞之外，接种的细胞悬液中的其它各种细胞都还存在。 这一时期的细胞生长能力逐渐旺盛，细胞的分裂活动逐渐增强。由于分裂的次数还不多，细胞之间发生相互影响，尤其是可能导致细胞性状发生改变的影响（如细胞融合）还不大，细胞的结构和功能与体内仍很相似，故原代培养期的细胞最接近在体时的情况,1、原代培养期,三）体外培养细胞的生长过程,二、体外培养物的细胞生物学特点,原代培养期细胞的主要生长生物学行为包括以下几个方面,1

17、）黏附与贴壁,2）铺展,3）细胞运动,4）细胞分裂,1、原代培养期,三）体外培养细胞的生长过程,二、体外培养物的细胞生物学特点,1）黏附与贴壁,黏附于固相表面是锚定依赖性细胞生命活动的基本要求。 分散生物体组织制成的细胞悬液，当被接种到培养器皿内以后，首先要发生黏附(adherence),即细胞要黏着或结合到生长基质表面上，这是细胞培养开始以后能否成功的第一步。 锚定依赖性细胞在解离成单个细胞悬液后耽搁得越久，越容易发生退化,1、原代培养期,三）体外培养细胞的生长过程,二、体外培养物的细胞生物学特点,贴壁（attachment）与黏附只是程度上的不同，没有截然的界限。 贴壁可以理解为，培养细胞

18、黏附以后更进一步地与生长表面结合的过程。 黏附的细胞可能通过少数接触点与生长表面结合，而贴壁的细胞会以整个接触面与生长表面牢靠结合,1）黏附与贴壁,1、原代培养期,三）体外培养细胞的生长过程,二、体外培养物的细胞生物学特点,不同细胞的黏附能力不同。 有些细胞如巨噬细胞、成纤维细胞的黏附能力强，这些细胞被接种到培养器皿内以后，能在数分钟至数十分钟内黏附到固相表面。 而有的细胞如神经元细胞、羊水细胞，其黏附能力弱，当被接种到培养器皿内以后，需要数小时乃至更长的时间才能黏附到固相表面,1）黏附与贴壁,1、原代培养期,三）体外培养细胞的生长过程,二、体外培养物的细胞生物学特点,降低培养液 的悬浮力,减

19、少接种时细胞悬液的量，以小量细胞悬液接种，使得细胞只需下沉很短的距离即可触及生长表面。待细胞黏附和贴壁之后，再补充足够的培养液。 *减少培养液中血清的含量使培养液的黏度降低,促进 因素,使用细胞外 基质成分,1）黏附与贴壁,1、原代培养期,三）体外培养细胞的生长过程,二、体外培养物的细胞生物学特点,培养液中的离子成分及其浓度可影响细胞的黏附和贴壁（培养液中的Ca2+含量过低不利于细胞的黏附、贴壁和铺展,影响 因素,培养液的温度也会影响黏附和贴壁的速度（低温会减低细胞的活动，妨碍黏附和贴壁,1）黏附与贴壁,1、原代培养期,三）体外培养细胞的生长过程,二、体外培养物的细胞生物学特点,2）铺展,铺展

20、（spread）是大多数培养细胞进行生命活动的一种基本的生长特点或生长行为。 对锚定依赖性细胞来说，铺展状况将制约着细胞的分裂增殖活动,1、原代培养期,三）体外培养细胞的生长过程,二、体外培养物的细胞生物学特点,细胞的铺展状况可用两种参数描述： 其一是培养细胞的面积大小，这一参数可以在显微镜下直接用测微尺测量； 其二是培养细胞的高度，实际上就是细胞在垂直方向上的厚度（可以通过在显微镜下观察已发生铺展的细胞,2）铺展,1、原代培养期,三）体外培养细胞的生长过程,二、体外培养物的细胞生物学特点,扁平的极性细胞 （polarized cell,放射状铺展细胞持续 0.5-2h便逐渐铺开伸展,铺展过程

21、 细胞的 形态变化,细胞：圆形,细胞：圆饼形 称为放射状铺展细胞 （radial spread cell),2）铺展,1、原代培养期,三）体外培养细胞的生长过程,二、体外培养物的细胞生物学特点,极性细胞就是各种有机体细胞在体外的特征性细胞形态，有的为梭形、有的为三角形、有的为其它不规则形态等等。 培养细胞铺展以后的极性细胞形态不是固定不变的，相反，会随着细胞的生命活动尤其是细胞运动而发生改变,2）铺展,1、原代培养期,三）体外培养细胞的生长过程,二、体外培养物的细胞生物学特点,铺展以后的细胞在相差显微镜下进行观察，细胞轮廓清楚，胞核隐约可见，常可看到核仁。在每一个细胞的周围，有一圈亮的光晕，称

22、为生长晕（growth hallow）。 这是细胞与周围生长基质之间厚度不同而产生的一种光学现象,2）铺展,1、原代培养期,三）体外培养细胞的生长过程,二、体外培养物的细胞生物学特点,海马神经元 （培养7d,生长状况良好的细胞，细胞透亮匀质，生长晕明显。 细胞生长状况不良时，细胞色暗、轮廓明显、反差增大，有时候胞质内出现小的颗粒结构和泡状结构，可能分别为变形的线粒体及液泡（溶酶体,2）铺展,1、原代培养期,三）体外培养细胞的生长过程,二、体外培养物的细胞生物学特点,3）细胞运动,原代培养期内，细胞常常会发生活跃的运动。有时候，甚至可从生长基质的某处迁移到另处。 细胞的运动与细胞质周边部分伸出的

23、伪足有关，伪足可分为丝状和片状两种。 这些伪足向外伸出后，在适当的生长基质部位停留或者附着在某处，细胞体内部的微管和微丝重新排列，进一步引起胞质的流动,1、原代培养期,三）体外培养细胞的生长过程,二、体外培养物的细胞生物学特点,4）细胞分裂,对大多数在体内可分裂的细胞来讲，体外培养时细胞能否恢复分裂增殖活动、恢复得快慢以及分裂能力的大小等关系到整个培养的效果。 一般来说，原代培养的细胞至少要渡过2496h甚至更长的潜伏期才能恢复分裂,1、原代培养期,三）体外培养细胞的生长过程,二、体外培养物的细胞生物学特点,不同细胞分裂增殖活动恢复得快慢不同。 * 肿瘤细胞比正常二倍体细胞恢复得快。 * 在体

24、内原本增殖能力强的细胞恢复得快。 * 原代培养时接种的细胞密度越大，潜伏期越 短，细胞分裂增殖活动恢复得越快。 * 培养条件适宜、稳定，营养供应充足，细胞 分裂增殖活动恢复得快,4）细胞分裂,1、原代培养期,三）体外培养细胞的生长过程,二、体外培养物的细胞生物学特点,2、传代培养期,一旦原代培养物经过分割，重新接种到两个或两个以上的器皿内进行培养，就标志着原代培养期结束，培养过程进入了传（继）代培养期。 原则上，传代是以原代培养物贴壁生长，长满培养器皿的生长面（器皿的底壁）或者在悬浮培养状态下细胞密度足够大时进行。但传代的具体时间并不是固定的，操作者可以根据具体情况安排传代时间。 但是，提前或

25、推后传代（尤其是后者）都不好,三）体外培养细胞的生长过程,二、体外培养物的细胞生物学特点,在这一时期内，最主要的特征是细胞分裂增殖活动旺盛，细胞生长活跃。 传代培养期并不单指原代培养物经首次传代后的“第一代”培养过程，而是指由首次传代开始经反复传代，一直到培养物开始衰退之前的全部时间。 按照体外培养技术领域的传统概念，分离（散）细胞培养物一旦经过传代即改称为细胞系。细胞系可以继续传代。因此，从培养物的角度来讲，传代培养期就是维持细胞系增殖、生长的培养过程,2、传代培养期,三）体外培养细胞的生长过程,二、体外培养物的细胞生物学特点,传代培养期是整个培养过程的主要时期，此期具有以下特点： 持续时间

26、长、细胞分裂增殖活动旺盛以及细胞生长活跃。 在传代培养期内，细胞逐渐进入去分化状态。原本成分混杂的培养物中，某一种增殖能力较强的细胞会逐渐处于优势，比例越来越大，而将其它数量较少、比例较小的细胞逐渐淘汰掉,2、传代培养期,三）体外培养细胞的生长过程,二、体外培养物的细胞生物学特点,在传代培养期内，需要进行多次的传代。 在每一次人为的传代培养过程中，培养物将首先被蛋白酶消化而被制备成细胞悬液，再用于种植。种植后的细胞都要经历相似的恢复和生长过程。 根据每一次传代培养的细胞生长变化的过程，习惯上把每一代细胞的生长过程分为潜伏期、指数生长期和停滞期三个阶段,2、传代培养期,三）体外培养细胞的生长过程

27、,二、体外培养物的细胞生物学特点,1）潜伏期(latent phase,即细胞对传代操作所致损伤的恢复期和对新的生长环境的适应期。这也是原代培养开始时细胞必须经历的时期,2、传代培养期,三）体外培养细胞的生长过程,二、体外培养物的细胞生物学特点,不论是原代培养前从生物体组织分离（散）制备细胞悬液，还是在进行传代操作时，都要使用蛋白酶消化或其它生物化学试剂，使细胞表面与其它细胞以及支持物黏附与连接的分子被破坏，细胞受到损伤，分散的细胞悬液，全部细胞变为圆球形。 接种到培养器皿内以后，细胞开始经历与原代培养期内相似的黏附、贴壁、铺展等过程。修复损伤，“熟悉”环境，恢复生长，但很少分裂,1）潜伏期(

28、latent phase,2、传代培养期,三）体外培养细胞的生长过程,二、体外培养物的细胞生物学特点,潜伏期的长短与细胞种类、接种的细胞密度、培养条件等因素均有关。接种的细胞密度越大、数量越多，细胞群体越容易适应体外环境，潜伏期就短，相反，即便是在很小的培养空间内，如果接种的细胞数量不够大，潜伏期仍会较长。 传代培养细胞的潜伏期要比原代培养的细胞短。传代培养期的细胞，潜伏期一般为期624 h。 当细胞开始分裂，意味着细胞已完全恢复生长状态，潜伏期结束,1）潜伏期(latent phase,2、传代培养期,三）体外培养细胞的生长过程,二、体外培养物的细胞生物学特点,2）指数生长期(或称对数生长期

29、,logarithmic growth phase,它是细胞增生最活跃、活力最旺盛的阶段，培养物中的细胞数量呈指数增长。 指数生长期内细胞分裂活动的程度（即增殖活性）可以作为判断细胞生长是否旺盛的重要指标。 常以有丝分裂指数（mitotic index，MI）、细胞群体倍增时间来表示。MI是指培养物中分裂相数量占全部细胞数量的百分比,2、传代培养期,三）体外培养细胞的生长过程,二、体外培养物的细胞生物学特点,细胞的增殖活性与细胞种类、供体年龄以及培养条件等多种因素密切相关。 一般细胞的MI约为0.1%0.5%。原代培养物的MI比继代培养物的MI低。连续细胞系和肿瘤细胞的MI较高，可达3%5%。

30、 在接种的细胞数量适中、培养条件适宜的情况下，指数生长期一般持续35d，细胞即可长满培养器皿，相互汇合成片,2）指数生长期(或称对数生长期,logarithmic growth phase,2、传代培养期,三）体外培养细胞的生长过程,二、体外培养物的细胞生物学特点,如果培养的是正常有机体细胞（非转化细胞），当细胞相互接触连接成片时，细胞便不再运动，表现出由于接触而相互抑制的特征，此即为接触抑制。 细胞在发生接触抑制以后，虽然运动受到抑制，但只要营养成分充足，仍然可进行短期的分裂增殖。 只有当细胞密度增大到一定程度，相互拥挤或挤压而致铺展程度降低细胞变高（厚），使得DNA合成受到限制时，细胞便不

31、再分裂增殖,2）指数生长期(或称对数生长期,logarithmic growth phase,2、传代培养期,三）体外培养细胞的生长过程,二、体外培养物的细胞生物学特点,肿瘤细胞没有接触抑制现象。 没有接触抑制特征的恶性细胞即便是发生相互接触，但仍然可以运动和增殖，于是会在所形成的单层细胞层上继续堆叠,由于细胞密度增大而致的分裂抑制现象被称为密度依赖性细胞生长抑制,2）指数生长期(或称对数生长期,logarithmic growth phase,2、传代培养期,三）体外培养细胞的生长过程,二、体外培养物的细胞生物学特点,3）停滞期（stagnate phase,plateau phase) 或

32、平台期,意即细胞不再分裂增殖，细胞数量维持在某一水平上，生长活动停滞。 此时细胞仍有代谢活动，但因细胞数量多、营养消耗大、培养液中代谢废物积聚渐多，细胞生长活动极为缓慢。 即便经常更换培养液也会因其迅速酸化而致细胞发生酸中毒、发生变性和从生长基质表面脱落死亡。 唯有进行传代方可缓解“人口压力,2、传代培养期,三）体外培养细胞的生长过程,二、体外培养物的细胞生物学特点,在实际工作中，一旦发现培养物长满培养空间就进行传代，完全不必进入或维持停滞期。 若细胞已经发生酸中毒，即使进行传代，也会影响下一代细胞的功能状况。 酸中毒对细胞造成的损伤，至少需再经过12次传代之后，才能修复损失、淘汰掉死细胞，恢

33、复旺盛的生长状态,3）停滞期（stagnate phase,plateau phase) 或平台期,2、传代培养期,三）体外培养细胞的生长过程,二、体外培养物的细胞生物学特点,对于每一代培养细胞都可以在接种以后的不同培养时间计数培养物的细胞数量（实际操作时，一般以细胞密度代替），然后，绘制出时间密度曲线，作为培养细胞的生长曲线。 不同种类的细胞，其生长曲线各有特点。 生长曲线可反映细胞的生物学特征,3）停滞期（stagnate phase,plateau phase) 或平台期,2、传代培养期,三）体外培养细胞的生长过程,二、体外培养物的细胞生物学特点,3、衰退期,传代培养到一定的代数时，细胞

34、的生命活动明显减弱。细胞虽然生存，但生长缓慢、很少分裂增殖甚或不再分裂，培养物很难再长满培养空间，即便是及时换液也无济于事。 这表明培养物已经进入衰退期，再向前发展，只有退化、死亡。 此时，用相差显微镜观察可见细胞轮廓增强，色泽变暗，细胞质内出现暗的颗粒样结构以及空泡状结构。胞质突起回缩，突起边缘有时可脱落,三）体外培养细胞的生长过程,二、体外培养物的细胞生物学特点,衰退期不同于上面讲到的每一代培养细胞的停滞期。 处于停滞期的细胞可通过传代进行挽救，而处于衰退期的细胞以任何方法都不能阻止其向死亡方向发展,3、衰退期,三）体外培养细胞的生长过程,二、体外培养物的细胞生物学特点,四）体外培养细胞的

35、形态学,1、显微结构,总的来讲： 培养的细胞与其在体内时的形态结构相似,上皮组织的细胞 经培养后仍主要呈现上皮细胞的形态： 如形态较为规整、扁平、没有特别明显的胞质突起、细胞之间容易形成类似上皮样的胞体接触等,二、体外培养物的细胞生物学特点,培养中的上皮细胞,结缔组织的细胞 经培养后仍主要呈现结缔组织细胞的形态： 如形态一般不规整、有较多较复杂的胞质突起，胞体不容易接触，但胞突常相互接触，细胞松散，似结缔组织,四）体外培养细胞的形态学,1、显微结构,总的来讲： 培养的细胞与其在体内时的形态结构相似,二、体外培养物的细胞生物学特点,培养中的成纤维细胞,肌肉组织的细胞 经培养后仍主要呈现肌肉细胞的

36、形态： 如细长如管、有时出现横纹（骨骼肌和心肌）等,四）体外培养细胞的形态学,1、显微结构,总的来讲： 培养的细胞与其在体内时的形态结构相似,二、体外培养物的细胞生物学特点,培养中的心肌细胞,神经组织的细胞 经培养后仍主要呈现神经细胞的形态： 如细胞分出明确的胞体与胞突、突起的数量和形态学特征与体内同种细胞的相似、细胞核及核仁明显（神经元、星形胶质细胞）、不同神经细胞（神经元和胶质细胞）的大小比例等,四）体外培养细胞的形态学,1、显微结构,总的来讲： 培养的细胞与其在体内时的形态结构相似,二、体外培养物的细胞生物学特点,培养中的神经细胞,然而，将细胞从体内复杂的环境转移到体外较为均一的环境中生

37、长，生长环境发生了巨大变化。 原本在体内形形色色的各种细胞形态，在失去了体内细胞之间的那种相互影响压力之后，表型上发生去分化变化，形态上表现雷同的外观,四）体外培养细胞的形态学,1、显微结构,二、体外培养物的细胞生物学特点,刚接种时，所有的细胞均为圆球形。 相差显微镜下只能看见一个个亮圈而看不到细胞核。圆球形细胞的大小给人以远远小于在体组织切片上看到的外观之印象。 随着细胞的黏附、贴壁或铺展，细胞变扁，呈现出较为特异性的外观,四）体外培养细胞的形态学,1、显微结构,二、体外培养物的细胞生物学特点,培养的细胞，在形态学上的特征，只可以在接种的对象明确的情况下，大致表明出细胞类型。 如果要确认培养

38、物中的细胞种类，必须借助特异性的鉴别方法加以识别。 最常使用的方法是以细胞的某种特异性蛋白质或肽的抗体进行免疫细胞化学染色鉴定,四）体外培养细胞的形态学,1、显微结构,二、体外培养物的细胞生物学特点,2、超微结构,透射电镜下，一般看不到培养细胞与在体细胞的形态结构方面有什么明显的差异。培养细胞显示出与体内相应细胞有更多的相似性。 扫描电镜下，培养的细胞与在体的细胞形态结构差别较大，主要表现在细胞的外形上。 培养的细胞尤其是迁移活动旺盛的细胞，一般出现更多的突起，以肿瘤细胞为甚,四）体外培养细胞的形态学,二、体外培养物的细胞生物学特点,五）植块培养物的生长生物学,体外培养的植块主要有组织块和器官

39、型植块两种。 虽然不同的植块培养物生长状况有所不同，但大致有一些共性。对于大多数动物组织而言，植块经过短期(13d)培养后，植块内的细胞都会从植块向外迁移，这是一个普遍现象。 不同细胞从植块开始迁移的时间、迁出的数量以及迁移活动的高峰期有所不同,二、体外培养物的细胞生物学特点,随着培养时间延长，细胞不断迁出，迁移出来的细胞不断分裂增殖，最后都会在植块周围形成一圈细胞。在植块周围形成了一个由细胞组成的，好像日月的光“晕（halo）”一样的晕圈。 对于有些迁移能力不强的组织细胞，如神经组织植块或肌肉组织植块的细胞，在植块所附带的结缔组织成分不多的情况下，短时间内培养，从植块迁移出来的细胞可能会很少

40、，甚至没有细胞外迁,五）植块培养物的生长生物学,二、体外培养物的细胞生物学特点,从植块迁移出来的细胞，其细胞生物学特性与分离（散）细胞培养物有相似之处。 若以植块培养法借助细胞外迁来收集某种细胞时，在目的细胞充分外迁之后，但尚未发生接触抑制之前，应该及时进行传代培养,五）植块培养物的生长生物学,二、体外培养物的细胞生物学特点,三、影响动物细胞体外生长的因素,体外培养的动物细胞脱离了在体时的调节和控制，独立面对生长环境中的各种因素，只有适应体外环境条件才能生长。除了向培养基（液）中释放代谢产物或者分泌一些生物活性物质而影响培养基（液）之外，几乎对生长环境产生不了什么较大的主动影响。 如果环境因素

41、发生改变，将会对细胞生长带来明显影响。能够影响体外培养的细胞生长的因素很多，例如营养条件、培养温度、培养液的酸碱度、氧张力等,一）营养成分与生长基质成分对细胞生长的影响,二）温度条件对细胞生长的影响,三）气相环境对细胞生长的影响,四）培养液的酸碱度对细胞生长的影响,五）辐射线对细胞生长的影响,六）超声波对细胞生长的影响,七）影响细胞生长的其它因素,三、影响动物细胞体外生长的因素,一）营养成分与生长基质成分对细胞生长的影响,体外培养细胞的营养条件主要是通过培养液来提供的。 在培养液中，除了细胞生命活动所需的各种营养物质之外，还必须提供调节细胞生长与功能活动的激素、生长因子以及生长基质成分等。 尽

42、管已开发的各种人工合成培养基成分复杂而且明确，但始终缺乏某些尚不清楚的与细胞生长发育和功能活动有关的微量成分。 故体外培养动物细胞的培养液中一般仍需要加入5%20%（V/ V)的血清,三、影响动物细胞体外生长的因素,1、血清的成分与作用,2、无血清培养液的设计及应用,3、生长基质成分,一）营养成分与生长基质成分对细胞生长的影响,三、影响动物细胞体外生长的因素,1、血清的成分与作用,血清是由很多分子量不同的生物分子组成的极为复杂的混合物，包括各种血浆蛋白质、肽类、脂肪、糖类（碳水化合物）、无机物质以及血小板凝集时释放的各种生长因子。 这些生长因子有的能促进某些细胞增殖，而有的能诱导某些细胞分化。

43、血清中既有促进细胞生长代谢的成分，又有抑制细胞生长活动的成分，从而实现对生长调节的平衡影响,1）血清的成分,一）营养成分与生长基质成分对细胞生长的影响,三、影响动物细胞体外生长的因素,2）血清在体外培养中的作用,血清在体外培养中的作用是多方面的。血清对于培养细胞的主要作用体现在以下几个方面,1）血清中含有基本的营养物质： 可以作为人工合成培养基中所缺乏的或者含量不足的营养成分的补充,1、血清的成分与作用,一）营养成分与生长基质成分对细胞生长的影响,三、影响动物细胞体外生长的因素,2）血清中含有激素与生长调节因子： 生长因子能够刺激细胞生长、分化与增生，激素能调节细胞多种生命活动,血清在体外培养

44、中的作用是多方面的。血清对于培养细胞的主要作用体现在以下几个方面,2）血清在体外培养中的作用,1、血清的成分与作用,一）营养成分与生长基质成分对细胞生长的影响,三、影响动物细胞体外生长的因素,3)血清中含有促进细胞黏附与铺展的因子： 主要是一些细胞外基质成分，如纤维连接蛋白（ fibronectin),对于贴壁依赖型细胞的黏附和铺展必不可少,血清在体外培养中的作用是多方面的。血清对于培养细胞的主要作用体现在以下几个方面,2）血清在体外培养中的作用,1、血清的成分与作用,一）营养成分与生长基质成分对细胞生长的影响,三、影响动物细胞体外生长的因素,4)血清中含有载体蛋白： 例如白蛋白与转铁蛋白等，

45、可结合并转运激素、维生素、无机盐成分（金属离子）以及脂肪（脂肪酸、胆固醇）等低分子量物质,血清在体外培养中的作用是多方面的。血清对于培养细胞的主要作用体现在以下几个方面,2）血清在体外培养中的作用,1、血清的成分与作用,一）营养成分与生长基质成分对细胞生长的影响,三、影响动物细胞体外生长的因素,5)血清中含有对抗机械损害的、非特异性的保护物质： 血清中的蛋白质成分可以增加培养液的粘度，对于保护细胞免受机械损伤是重要的,血清在体外培养中的作用是多方面的。血清对于培养细胞的主要作用体现在以下几个方面,2）血清在体外培养中的作用,1、血清的成分与作用,一）营养成分与生长基质成分对细胞生长的影响,三、

46、影响动物细胞体外生长的因素,6)血清中含有蛋白酶抑制剂： 有些组织细胞，如内皮细胞及一些死细胞，可以释放蛋白酶而对细胞造成损害。血清中的蛋白酶抑制剂可以起到中和作用。有些情况下，血清还具有中和毒性物质保护细胞的作用,血清在体外培养中的作用是多方面的。血清对于培养细胞的主要作用体现在以下几个方面,2）血清在体外培养中的作用,1、血清的成分与作用,一）营养成分与生长基质成分对细胞生长的影响,三、影响动物细胞体外生长的因素,7)血清中含有pH缓冲物质： 对稳定培养液的酸碱度是有意义的,血清在体外培养中的作用是多方面的。血清对于培养细胞的主要作用体现在以下几个方面,2）血清在体外培养中的作用,1、血清

47、的成分与作用,一）营养成分与生长基质成分对细胞生长的影响,三、影响动物细胞体外生长的因素,但是，培养液中添加血清也有诸多缺点,1）对于大多数动物细胞来讲，血清并不是细胞在体时直接接触的生理性液体，只有在伤口愈合以及血液凝固过程中才接触血清，此时血清对成纤维细胞的生长有促进作用而对表皮细胞的生长有抑制作用,2）血清在体外培养中的作用,1、血清的成分与作用,一）营养成分与生长基质成分对细胞生长的影响,三、影响动物细胞体外生长的因素,2）血清也具有潜在的细胞毒作用，除了特异性抑制成分、细菌毒素以及脂类成分之外，还含有多胺氧化酶。后者能与来自增殖活跃的细胞的多胺（如精胺、亚精胺）起反应，形成有细胞毒作

48、用的聚胺醛。 现已证明胎牛血清中多胺氧化酶的含量远比马血清中的要高,但是，培养液中添加血清也有诸多缺点,2）血清在体外培养中的作用,1、血清的成分与作用,一）营养成分与生长基质成分对细胞生长的影响,三、影响动物细胞体外生长的因素,3）血清的个体差异大，需要分批筛选。而且永远不可能保持批次间的一致； （4）在培养液中使用血清会增加成本，尤其是对于动物细胞的大规模培养以及使用胎牛血清培养的情况更是如此,但是，培养液中添加血清也有诸多缺点,2）血清在体外培养中的作用,1、血清的成分与作用,一）营养成分与生长基质成分对细胞生长的影响,三、影响动物细胞体外生长的因素,5）血清中有时所含的生长因子水平不足

49、而需要补充，若补充过量会抑制细胞生长。 培养批次与血清批次不同，生长因子水平是难以控制的,但是，培养液中添加血清也有诸多缺点,2）血清在体外培养中的作用,1、血清的成分与作用,一）营养成分与生长基质成分对细胞生长的影响,三、影响动物细胞体外生长的因素,常规动物细胞培养离不了血清，但又需避免血清的不良影响。 建议使用低血清与无血清培养液，这样可以尽量使培养条件标准化、实验重复性提高、减少成本、减少血清有害成分的影响、降低生化分析中蛋白质成分的干扰、防止原代培养过程中成纤维细胞的过度增长,2）血清在体外培养中的作用,1、血清的成分与作用,一）营养成分与生长基质成分对细胞生长的影响,三、影响动物细胞

50、体外生长的因素,2、无血清培养液的设计及应用,一般情况下，多数学者将无血清培养基（液）（serum-free medium，SFM）也称为化学限定性培养基或化学成分明确的培养基(chemically defined medium），但严格来讲，无血清培养基（液）并不是“化学成分明确”的同义词。 “无血清”仅代表培养液中未补加血清,一）营养成分与生长基质成分对细胞生长的影响,三、影响动物细胞体外生长的因素,1）培养基选择的一般考虑,首先要明确所要培养的细胞类型： *是寿命有限的正常二倍体细胞，还是已发生转化的细胞，或者是具有永生性的恶性细胞。 *是同质种群（同一细胞系、株）还是异质种群（不同细胞

51、成分混杂,迄今已开发的合成培养基很多，到底选用哪一种才适合所要培养的细胞,2、无血清培养液的设计及应用,一）营养成分与生长基质成分对细胞生长的影响,三、影响动物细胞体外生长的因素,其次要确定培养的目的：是维持细胞的生存（保持分化特征）；还是要使得细胞大量增生。 最后要确定：是否补加血清；以及补加的血清的最低限量,迄今已开发的合成培养基很多，到底选用哪一种才适合所要培养的细胞,1）培养基选择的一般考虑,2、无血清培养液的设计及应用,一）营养成分与生长基质成分对细胞生长的影响,三、影响动物细胞体外生长的因素,2）使培养细胞适应无血清培养液的基本策略,培养细胞从含血清培养液转入无血清培养液必然有一个

52、适应期，且因细胞类型不同长短各异。 虽然某些转化细胞转入无血清培养液中生长，在接种后潜伏期没有延长，但绝大多数细胞的活力降低。 从有血清培养液换成无血清培养液，一定要缓慢逐渐进行，并密切注意监测培养细胞的生长状况，随时对新培养液配方作出调整,2、无血清培养液的设计及应用,一）营养成分与生长基质成分对细胞生长的影响,三、影响动物细胞体外生长的因素,3、生长基质成分,生长基质成分对培养细胞尤其是贴壁依赖型细胞的生长是很重要的。 纤维连接蛋白主要促进中胚层来源的细胞贴壁生长；而层粘连蛋白主要促进内、外胚层来源的细胞贴壁生长。 有报道，层粘连蛋白在上皮样细胞的培养过程中能阻止成纤维细胞的过度增长,一）

53、营养成分与生长基质成分对细胞生长的影响,三、影响动物细胞体外生长的因素,二）温度条件对细胞生长的影响,1、生理温度范围,温度能够影响体内细胞代谢活动是早已定论的。在生理温度范围内，温度越高，酶活性越高，细胞代谢越快。这同样适合于体外培养的情况,体外培养动物细胞最常用的温度是37 。培养的细胞总的来说对较低温度的耐受能力比较高温度（一般不超过39）的强。高于生理温度阈值时，温度越高，对细胞损伤越大,三、影响动物细胞体外生长的因素,2、高温的影响,细胞无论是在体内、外环境中生存，当温度高于生理阈值时都可以造成细胞死亡,高温引起细胞死亡的原因主要在于以下几方面： (1)高温破坏了细胞内的酶： (2)高温能破坏细胞膜上的脂类： (3)高温影响细胞分裂,二）温度条件对细胞生长的影响,三、影响动物细胞体外生长的因素,3、低温的影响,总的来讲，培养细胞对低温的耐受力要强于对高温的耐受力。 在生理温度范围内，温度越低，酶活性越低。当温度降至细胞所能忍受的最低限度时，细胞的生命活动即会受到抑制。 但不同的动物以及微生物，其生理温度范围差别很大,二）温度条件对细胞生长的影响,三、影响动物细胞体外生长的因