糖化曲的制备及其酶活力的测定

1、发酵食品工艺学理论课教学大纲学时：36学分：2制订者：陈晓红审核者：徐幸莲一、 课程性质：食品科学与工程本科专业必修课二、教学目的与要求：发酵食品工艺学是一门综合性及实践性很强的课程，内容既以微生物生理及其发酵的生化机制、微生物遗传育种、代谢调节等理论为基础，又以化工原理、发酵动力学、发酵技术及设备等工科内容为支撑，要求学生通过本课程的学习，深入探讨发酵食品的微生物作用机制、发酵与酿造的调控等理论，了解发酵食品生产的工艺原理、产品的形态、种类及其卫生与安全等方面的基本知识，掌握发酵食品生产的工艺设计和品控措施、发酵生产的一般工程计算、新产品开发思路等技能。以适应食品研究开发、生产经营管理、质量

2、控制等各行业对人才知识结构的需求。三、课程内容改革内容上删减了部分总论内容，增加了固液态发酵的特点及调控、曲的微生物及生物化学、功能性发酵食品与食品添加剂、发酵食品的安全性、世界新型发酵食品等方面内容。理论教学采用实物投影、胶片投影、多媒体课件相结合的方法，实验实践教学分为三大模块：发酵工厂参观实习（实践）、基本技能和技巧训练、综合设计模拟试验。四、理论教学内容与学时安排第一章 绪论（2学时）1、什么是发酵、酿造2、发酵食品的渊源及其文化内涵3、发酵的微生物和工程技术发展史4、发酵食品工程及产品特点5、发酵技术的发展趋势及研究热点第二章 发酵与酿造食品的一般工艺和原理（3学时）第一节发酵的基本

3、要素及调控（1学时）1、发酵基质2、环境条件3、发酵微生物第二节 发酵生产一般工艺（1学时）1、发酵工艺类型2、固液态发酵的工艺过程3、固液态发酵的特点第三节 发酵食品形成的一般生化历程（1学时）1、原料降解2、目的产物转化3、产物再平衡第三章 发酵微生物及发酵剂（4学时）第一节通常参与发酵的微生物（第一、二节共1学时）第二节 生产用菌种的选育及保藏1、菌种选育的一般程序和方法2、生产菌种的保藏原则及措施第四节 发酵剂的类型及制备（第三、四节共3学时）1、生产发酵剂的概念及类型2、直投式发酵剂简介3、生产用发酵剂生产及使用原则第五节 曲的微生物学及生物化学1、中国曲的特点及存在形式2、种曲和曲

4、3、曲的生产工艺第四章 发酵与酿造过程调节控制（3学时）第一节发酵过程的代谢变化1、与代谢变化有关的参数2、代谢变化和代谢曲线第二节 深层液态发酵过程调控1、基质浓度的变化及控制2、温度变化及控制3、溶氧浓度及控制4、pH变化及控制5、泡沬的产生及消除6、发酵终点的判断7、无菌检查及异常发酵处理8、发酵的染菌及防止第三节 固态发酵过程调控1、固态发酵工程的特点2、固态发酵工程技术沿革3、固态发酵过程调控参数4、酿造调控第五章 酒精发酵与酿酒工艺学（10学时）第一节酒精发酵（一、二节共3学时）1、酒精发酵原料2、与酒精发酵有关的微生物3、酒精发酵生化机制4、酒精发酵工艺5、酒精蒸馏与精馏第二节

5、白酒酿造1、中国名酒简介2、白酒的种类、风味物质成分和品质评价3、白酒酿造工艺4、酒类陈酿的机理及催陈方法第三节 葡萄酒酿造（3学时）1、世界名酒及其历史简介2、葡萄酒的分类方法3、葡萄原料及制汁调整4、参与发酵的微生物及发酵机制5、葡萄酒发酵工艺第四节 啤酒酿造（3学时）1、啤酒种类及其品质2、啤酒酿造原料3、麦芽制造4、麦汁制备5、发酵工艺6、过滤和灌装第五节 黄酒酿造（1学时）1、黄酒的种类2、黄酒原料及曲3、黄酒工艺第六章 醋酸发酵与酿醋工艺学（4学时）第一节 醋酸发酵工艺1、参与的微生物2、醋酸发酵的工艺类型3、醋酸的提取及后加工第二节 食醋生产工艺1、食醋的成分和功能性2、生产用原

6、料及预处理3、食醋的固态发酵工艺4、食醋的液态深层发酵工艺第七章 酱油及豆制品发酵工艺学（6学时）第一节酱类与酱油酿造（第一、二节共4学时）1、酱类与酱油酿造原料2、酱类与酱油酿造的微生物及菌群演替3、酿造理论4、酱油酿造工艺及新技术应用5、制酱工艺第二节腐乳制造工艺1、腐乳制造技术沿革2、腐乳类型及产品特点3、腐乳的原料及处理4、腐乳发酵5、腐乳生产中常见问题及解决措施第三节豆豉及纳豆（1学时）1、豆豉的产品特性2、传统豆豉生产过程及微生物菌群演替3、纳豆的产品特性4、纳豆菌及纳豆生产第六节 丹贝生产工艺（1学时）1、生产原料及预处理2、丹贝生产工艺3、丹贝发酵过程控制4、丹贝及其衍生产品的

7、功能性第八章 微生物性功能食品与食品添加剂（2学时）第一节功能性发酵制品1、微生物多糖2、活性肽3、功能性发酵乳制品和肉制品第三节 微生物性食品添加剂1、黄原胶2、红曲及食用微生物色素3、乳酸菌素及生物防腐剂4、细菌纤维素5、微生物性风味物质第九章 发酵食品的安全性（2学时）第一节发酵食品安全性问题起源第二节微生物代谢产物安全性1、霉菌发酵产品安全性2、细菌发酵产品安全性3、微生物发酵的旁路代谢产物安全性发酵食品工艺学实验教学大纲学时：18学分：1制订者：陈晓红审核者：徐幸莲一、面向专业：食品科学与工程二、实验内容和学时分配：本实验课共有9个实验，其中验证性实验3个，设计性实验2个，综合性实验

8、4个。三、具体实验内容：实验一 小曲中霉菌、酵母菌的分离及纯化（3学时）目的要求：1、了解酒药中主要的霉菌及酵母菌2、掌握根霉菌、酵母菌的生长特点及分离技巧3、掌握霉菌的菌种转接及纯化方法实验二孢子悬浮液的制备及孢子发芽力的测定（3学时）目的要求：1、掌握孢子悬浮液制备及孢子发芽力测定的基本原理2、学会判断孢子质量的方法3、掌握孢子发芽力的测定方法实验三菌种保藏（3学时）目的要求：1、了解不同菌种保藏的基本原则2、掌握细菌的冻干及甘油管保藏、孢子的砂土管保藏、酵母菌的低温斜面保藏方法实验四市售活性干酵母发酵力的测定及发酵过程中菌体形态观察（3学时）目的要求：1、了解常用的酵母发酵力测定方法2、

9、掌握简单的酵母发酵力测定方法3、学会观察发酵液中酵母菌的发芽繁殖过程及发酵液中酵母菌死活细胞的区分方法（美兰染色）实验五发酵剂的制备及不同菌种比例对酸奶产品品质的影响（3学时）目的要求：1、掌握乳酸菌的菌种活化及其活力判断方法2、掌握酸奶发酵剂常用的菌种比例及其对产品品质影响的机理3、掌握乳酸菌发酵酸奶的工艺综合模拟试验（共3至4天）：实验六谷氨酸生产种子制备及种子质量检查目的要求：1、掌握谷氨酸生产一级、二级种子制备的程序2、了解发酵种子质量指标并学会判断3、掌握生产种子制备的一般原则实验七谷氨酸发酵罐发酵目的要求：1、掌握谷氨酸发酵的基本操作流程2、掌握发酵罐的四大系统及空消、实消的注意事

10、项3、了解发酵罐压差接种步骤、掌握火圈接种方法4、学会发酵罐发酵的过程管理实验八无菌检查目的要求：1、观察谷氨酸发酵菌种的基本形态2、掌握平板划线、直接镜检法进行无菌检查3、判断发酵过程是否染菌实验九发酵过程代谢曲线测定目的要求2、掌握发酵液中菌体生物量、总糖、谷氨酸量、pH的测定方法3、绘制发酵过程代谢曲线实验十发酵终点判断及发酵液后处理目的要求：1、了解谷氨酸发酵终点判断的主要指标2、掌握终止发酵的方法3、学会进行发酵液的后处理四、成绩考核：考核方式为实验过程中操作技能抽检，并结合实验报告质量打分。发酵食品工艺学实践教学大纲学时：9学分：制订者：陈晓红审核者：徐幸莲一、目的要求：通过参观实

11、习，让学生了解发酵工厂的基本格局、发酵产品的品控措施及检测方法、CIP设备及流程、发酵罐构造及工艺设计理念。二、基本内容及时间地点：1、南京机轮调味品有限公司参观实习（半天）内容：了解固态发酵调味品的现代化工艺流程、圆盘制曲机械构造、酱油的品控措施及主要技术指标、了解发酵工厂的废水处理措施。2、南京金陵啤酒有限公司参观实习（半天）内容：了解啤酒的种类及不同品种的工艺差别，认识酒花、麦芽及其类型，观察糖化车间的布局特点，了解发酵车间罐体、管道的在线清洗和灭菌的现代方法，认识啤酒后加工的设备等。3、南京奶业集团发酵乳车间实习（半天）内容：了解发酵乳的原料要求及原料乳的品控方法（快速检测），认知大规

12、模发酵乳生产的工艺及关键控制点，建立无菌空间及管道的设计理念。三、成绩考核：考核方式为以课堂交流的形式考察学生的认知程度。实验一小曲中根霉菌的分离纯化及酒酿制作一、实验目的：1、了解小曲的多种形态、其中的主要微生物及其在米酒发酵中的作用2、根据根霉菌生长特性设计特有的分离及形态观察方法3、掌握酒酿制作的基本原理、实验方法及品质控制和评定方法二、实验原理：小曲中通常含有根霉、毛霉及酵母菌，还有一些特有的酶类，在米酒酿造中根霉菌通常起双边发酵的作用，因此根霉种类、发酵特性对于产品的特性品质具有非常重要的意义。根霉在人工培养基或自然基物上生长时，菌丝体向空间延伸，遇光滑平面后营养菌丝体形成葡蔔枝，节

13、间产生假根，假根处葡蔔枝上着生成群的孢子囊梗，柄顶端膨大形成孢子囊，囊内产生孢子囊孢子。进行根霉菌分离时常利用此生长和形态特性判断是否根霉菌，再挑取单个孢子囊孢子进行纯化。酒酿制作所用原料多为糥米，其主要成分为淀粉，经过蒸煮糊化后，利用小曲中根霉菌较强的液化和糖化能力将其中的淀粉降解为不可酵糖和可酵糖，由淀粉降解为葡萄糖等还原糖的过程通常称为糖化，可酵糖供根霉菌本身的酒化酶及酵母菌利用产生酒精，不可酵糖则残留在发酵醪中形成米酒或酒酿特有的体和甜香味。不同品牌小曲中的根霉菌菌种不同，发酵时间和其它环境条件要求也不同，通过对发酵过程中还原糖、酒精度等参数的测定，结合发酵物的感官评定，判断是否终止发

14、酵。三、试剂和器材：安琪牌米酒酒药，PDA培养基，糥米等培养皿，载玻片，显微镜，蒸饭设备，发酵器皿等四、方法与步骤：（一）根霉菌的分离和鉴定：1、分离方法本实验直接用融化的玉脂培养基稀释分离。这一方法对于在原材料中占较大数量比例的微生物尤为适用。（1）酒精洗研钵、烧灼、杀菌。将0.5g酒药放入钵中，加无菌水5ml，研磨成粉。（2）琼脂培养基融化后，冷地至45（置45水溶中）。（3）取其中的一支试管，用接种环挑取待分离材料少许。放入试管中已融化为液状的琼脂培养基中，赛回棉赛、双手摇搓度管，使接种物混匀。（4）取第2根试管，用接种环从第一管中取12环接入第2管中，如上法混匀，再同法移入第3管中。（

15、5）依次把3支试管培养分别倾入3个已灭菌的培养皿中制成平板，置2528的恒温箱内培养。操作过程图解如下：图1 稀释分离法示意图（6）培养1718小时后，透过平皿对光观察，有无菌丝生长，用接种针挑挖菌丝少许。接于斜面培养基上，即可纯化。2、鉴定方法（1）分别挑取匍枝根霉和另一根霉属未知菌种的少量孢子，接入含有普氏培养液的试管中（每个菌种接6支，共接12支），每个菌种各取2支分别置28、37、45培养23天。（2）取任意两分离株，分别以八字形划线接种，在同一PDA平报的两侧见图2。（共接2个平板）置25培养45天。图2 八字形划线接种法（3）特征观察肉眼观察观察上述和分离株的菌落特征。观察匍枝根霉

16、和根霉属另一分离株在不同温度的普氏fer氏培养液中的生长情况。镜检1）培养物直接观察无性阶段特征观察：将长有上述菌种的平板直接置于低倍镜下，分别观察它的孢囊、形状、着生位置及分枝情况，孢子囊的形状，并注意有无假根特征。有性阶段性特征观察：用低倍或高倍显微镜观察，根霉属未和菌种是否形成接合孢子。2）培养物制片观察制片：滴一滴乳酸苯酚于洁净载玻片中央，用一无菌的解剖针挑取少量平板中的培养物。浸入载玻片上的乳酸苯酚液内，而后用两根无菌的解剖针将菌丝撕开，使其全部打湿，盖上盖玻片。即成临时性载片标本。无性阶段特征观察：用装有已标定过的目镜测微尺的低倍或高倍显微镜观察孢囊梗的形状、大小、颜色、排列、着生

17、位置和分枝情况；孢子囊和孢囊孢籽的形状、大小、纹饰和颜色；囊轴的形状、大小、纹饰和颜色；囊托的形状、大小和颜色，并注意有无厚垣孢子（包括着生位置和假根，以及假根的形状，发达程度和颜色等特征）。有性阶段特征观察：用低倍或高倍显微镜观察接合孢子有无，若有则注意观察接合孢子的形状、大小和附属丝等特征。五、结果记录与思考题1将上述观察到的各项结果分别填入表1中。2绘制上述各菌种的形态特征图（如有接合孢子，也需绘制）。3根据观察结果：分别查阅根霉（附表，常见种检索表，将以上未知分离菌株鉴定到种。（二）酒酿制作：工艺流程糥米 清洗 浸泡 蒸饭 淋饭 拌药 搭窝 发酵各工序要点：(1) 糥米浸泡和般以10到

18、13为宜，时间约24小时，可因温度不同而调整浸泡时间。(2) 蒸饭即糊化过程，也称为淀粉的熟化，对蛋白质而言可使其变性，时间一般为上汽后半小时左右，要求饭粒熟而不烂，饭粒完整。(3) 淋饭目的在于：降温；去除饭粒表面粘物以免发酵中粘连成团不利发酵。用洁净自来水冲淋至35左右。(4) 拌药：用量和般为千分之一至千分之五，拌药时注意洁净。(5) 发酵时间和温度视不同酒药及菌种而定。五、结果与分析：1、描述根霉菌的形态2、发酵期间为什么要进行搅拌？制作甜酒酿的关键操作是什么？3、描述酒酿发酵过程中醅的变化，评定所制得的酒酿的品质实验二孢子悬浮液制备及孢子数测定一、实验原理孢子制备是发酵工业生产中不可

19、缺少的一个环节，孢子质量的好坏将直接影响到发酵生产的成功与否。孢子制备一般采用琼脂斜面培养基或一般固体培养基经接种后在适宜的条件下进行培养而得，制备的孢子在外观上应生长丰满、色泽正常、无杂菌污染且发酵单位高、生产性能稳定。斜面或其它固体培养基中的孢子数量是衡量孢子质量的一个重要指标。孢子数的测定可采用血球计数板在显微镜下直接进行测定。二、实验器材（一）材料1PDA培养基2麸皮（市售）3菌种：黑曲霉Co827（柠檬酸产生菌）（二）仪器设备1显微镜2三角瓶（250ml）3血球计算板4高压灭菌锅三、操作步骤1马苓薯培养基（PDA）配制：马铃薯（去皮）200g、蔗糖（或葡萄糖）20g、琼脂20g、水1

20、000ml，将马铃薯去皮切成小块，于锅中加水1000ml煮沸半小时，用双层纱布过滤，取其滤液加糖及琼脂完全溶解后加水补充至1000ml，pH自然。分装于试管后于121灭菌30分钟，冷却放置斜面即可。2麸曲培养基制备：取市售、无霉变麸皮过筛去除细粉（50目筛），称取8g麸皮，加入250ml三有瓶中，加水约8ml拌均，于121灭菌30min即得。3接种：取Co827菌种一支，采用无菌操作对斜面及麸曲瓶进行接种，其中麸曲瓶中接入一环原种孢子即可。4培养：将斜面及麸曲瓶置于培养箱内，321培养。斜面培养时间为67d；麸曲瓶培养810d，麸曲培养过程中要求每天翻动一次，直至有孢子产生时停止翻动。培养完成

21、后即得斜面孢子及麸曲孢子。5孢子数测定：（1）取已培养好的Co827斜面菌种一支，加入5ml无菌水，轻轻将琼脂表面的孢子刮下，将该孢子悬浮液置于已灭菌50ml三角瓶内，瓶中预先放置数粒无菌玻璃球，充分振摇后用灭菌的脱脂棉进行过滤，并用无菌水冲洗滤渣23次，最终使滤液体积达到10.0ml，待测孢子悬浮液即得。（2）将孢子悬浮液用无菌水稀释至10-2、10-3，吸取适量的稀释液至血球计数板的计数室内，然后加上盖玻片，静置约5min，先在低倍镜下找到计数室，再转换成高倍镜观察并计数。（3）计数时用16中格计数板，要按对角线方位，取左上、在下、右上、右下的4个中格（即100小格）的孢子数。如果是25中

22、格计数板，除数上述四格外，还需数中央1中格的孢子数（即80小格）。由于孢子在计数室中处于不同的空间位置，要在不同焦距下才能看到，因而观察时必须不断调节微调螺旋，方能数到全部孢子，防止遗漏。如孢子位于中格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。四、实验结果1正确描述斜面、麸曲瓶培养过程中菌丝生长及孢子形成的基本现象。2计算每ml悬浮液中的孢子数及每支斜面的孢子数孢子数（个/ml悬液）= 稀释倍数每支斜面孢子数=孢子数/ml悬液悬浮液总体积（ml）n为第小格中的孢子平均数（个）实验三酱油种曲孢子数及发芽率的测定（一）酱油种曲孢子数测定1 目的掌握应用血球计数板测定孢子数方法。

23、2 原理种曲是成曲的曲种，是保证成曲的关键，是酿制优质酱油的基础。种曲质量要求之一是含有足够的孢子数量，必须达到6109/g（干基计）以上，孢子旺盛、活力强、发芽率达85%以上，所以孢子数及其发芽率的测定是种曲质量控制的重要手段。测定孢子数方法有多种，本实验采用血球计数板在显微镜下直接计数，这是一种常用的细胞计数方法。此法是将孢子悬浮液放在血球计数板与盖片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室中的容积是一定的，所以可以根据在显微镜下观察到的孢子数目来计算单位体积的孢子总数。实验中，称样时要尽量防止孢子的飞扬。测定时，如果发现有许多孢子集结成团或成堆，说明样品稀释未能符合操作要求，因此必

24、须重新称生、振摇、稀释。生产实验中应用时，种曲通常以干物质计算。3 材料3.1 样品酱油种曲。3.2 仪器和器具盖玻片、旋涡均匀器、血球计数板、电子天平、显微镜。3.3 试剂95%酒精、稀硫酸（110）。4 流程曲种称量稀释过滤定容制计数板观察计数计算5 步骤5.1 样品稀释精确称取种曲1g（称准至0.002g），倒入盛有玻璃株的250mL三角瓶内，加入95%酒精5mL、无菌水20mL、稀硫酸（110）10mL，在旋涡均匀器上充分振摇，使种曲孢子分散，然后用3层纱布过滤，用无菌水反复冲洗，务使滤渣不含孢子，最后稀释至500mL。5.2 制计数板取洁净干燥的血球计数板盖上盖玻片，用无菌滴管取孢子

25、稀释液1小滴，滴于盖玻片的边缘处（不宜过多），让滴液自行渗入计数室中，注意不可有气泡产生。若有多余液滴，可用吸水纸吸干，静止5min，待孢子沉降。5.3 观察计数5.3.1 观察用低倍镜头和高倍镜头观察，由于稀释液中的孢子在血球计数板上处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，因而计数时必须逐格调动微调螺旋，才能不使之遗漏，如孢子位于格的线上，数上线不数下线，数左线不数右线。5.3.2 计数使用1625规格的计数板时，只计板上4个角上的4个中格（即100个小格），如果使用2516规格的计数板，除计4个角上的4个中格外，还需要计中央一个中格的数目（即80个小格）。每个样品重复观察计数不少于2

26、次，然后取其平均值。5.4 计数（1）1625的计数板孢子数（1/g）=（N/100）40010000（V/G）=4104（NV/G）式中：N为100小格内孢子总数；V为孢子稀释液体，mL；G为覆盖品质量，g。（2）2516的计数板孢子数（1/g）=（N/80）40010000（V/G）=5104（NV/G）式中：N为80小格内孢子总数；V为孢子稀释液体积，mL；G为样品质量，g。6 结果样品稀释至每个小格所含孢子数在10个以内较适宜，过多不易计数，应进行稀释调整。结果记入下表。计算次数各中格孢子数小格平均孢子数稀释倍数孢子数（1/g）平均值第一次第二次7 思考题用血球计数板测定孢子数有什么优

27、缺点？（二）孢子发芽率测定法1 目的学习孢子发芽率的测定方法。2 原理测定孢子发芽率的方法常有液体培养法和玻片培养法，部颁标准采用玻片培养法。本实验应用液体培养法制片在显微镜下直接观察测定孢子发芽率。孢子发芽率除受孢子本身活力影响外，培养基种类、培养温度、通气状况等因素也会直接影响到测定的结果。所以测定孢子发芽率时，要求选用固定的培养基和培养条件，才能准确反映其真实活力。3 材料3.1 样品种曲孢子粉。3.2 培养基察氏液体培养基。3.3 仪器及其他用品载玻片、盖玻片、显微镜、接种环、酒精灯、恒温摇床。4 流程种曲孢子粉接种恒温培养制标本片镜检计数5 方法5.1 接种用接种环挑取种曲少许接入含

28、察氏液体培养基的三角瓶中，置于30下摇床。5.2 制片用无菌滴管取上述培养液于载玻片上滴一滴，盖上盖玻片，注意不可产生气泡。5.3 镜检将标本片直接放在高倍镜下观察发芽情况，标本片至少同时做2个，连续观察2次以上，取平均值，每次观察不少于100个孢子发芽情况。5.4 计算发芽率=A/（A+B）100%式中：A为发芽孢子数；B为未发芽孢子数。6 结果（1）正确区分孢子的发芽和不发芽状态。（2）培养前要检查调整孢子接入量，以每个视野含孢子数1020个为宜。（3）实验结果记入下表。孢子发芽数（A）发芽和未发芽孢子数（A+B）发芽率%平均值7 思考题影响孢子发芽率的因素有哪些？哪些实验步骤容易造成结果

29、误差？实验四糖化曲的制备及其酶活力的测定1 目的（1）学习制作糖化曲的方法。（2）掌握糖化酶活力的测定原理和方法。2 原理2.1 淀粉糖化可发酵性糖糖化曲是发酵工业中普遍使用的淀粉糖化剂。种类很多，如大曲、小曲、麦曲和麸曲等。曲中菌类复杂，曲霉菌是酒精和白酒生产中常用的糖化菌，含有许多活性强的糖化酶，能把原料中的淀粉转变成可发酵性糖。在酒精和白酒生产中应用最广时，除供给其生长繁殖必需的营养、温度和湿度外，还必须进行适当的通风，以供给曲霉呼吸用氧。2.2 糖化酶活力的测定固体曲糖化酶活力的测定，采用可溶性淀粉为底物，在一定的pH值与温度条件下，使之水解为葡萄糖，以斐林试剂快速法测定。斐林试剂由甲

30、、乙液组成，甲液为硫酸铜溶液，乙液为氢氧化钠与酒石酸钾钠溶液。平时甲、乙液分别贮存，测定时，二者等体积混合。混合时硫酸铜与氢氧化钠反应，生成氢氧化铜沉淀，沉淀与酒石酸钾钠反应，生成酒石酸钠铜络合物，使氢氧化铜溶解。酒石酸钾钠铜络合物中二价铜是一个氧化剂。能使还原糖中的羰基氧化，而二价铜被还原成一价的氧化亚铜沉淀。反应终点用次甲基蓝指示显示。由于次甲基蓝氧化能力较二价铜弱，故待二价铜全部被还原后，过量1滴还原糖被次甲基蓝氧化，次甲基蓝本身被还原，溶液蓝色消失以示终点。温度对糖化酶活力影响甚大，糖化温度一定要严格控制。反应是在强碱性溶液沸腾情况下进行，产物极为复杂，为得到正确的结果，必须严格按操作

31、规程进行。斐林试剂甲、乙液平时应分别贮存，用时混合。反应液的酸碱度要一致，要严格控制反应液的体积。反应时温度需一致，温度恒定后才加热，并控制在2min内沸腾。滴定速度需一致（按1滴/45s的速度进行）。反应产物中氧化亚铜极不稳定，易被空气所氧化而增加耗糖量。故滴定时不能随意摇动三角瓶，更不能从电炉上取下后再行滴定。3 材料3.1 菌种AS3.4309黑曲霉斜面试管菌。3.2 培养料麸皮、稻皮。3.3 试剂斐林试剂、0.1%标准葡萄糖溶液、pH值4.6的乙酸乙酸钠缓冲液、可溶性淀粉溶液、0.1mol/L NaOH溶液。3.4 仪器和器具恒温水浴箱、恒温培养箱、高压锅、瓷盘、试管、三角瓶、50mL

32、 比色管或容量瓶、酸式滴定管。4 流程4.1 麸曲制备斜面试管菌活化麸皮水拌料润料装瓶灭菌冷却接种培养三角瓶种曲麸水水拌料蒸料冷却接种装盘培养晾干麸曲4.2 糖化酶活力测定麸曲浸出液固体糖化液定糖糖化液测定计算结果记录5 方法5.1 糖化曲制备（以浅盘麸曲为例）5.1.1 菌种的活化无菌操作取原试管菌1环接入察氏培养基斜面，或用无菌水稀释法接种，31保温培养47d，取出，备用。5.1.2 三角瓶种曲培养称取一定量的麸皮，加入70%80%水，搅拦均匀，润料1h，装瓶，料厚1.01.5cm，包扎，在9.8104Pa压力下灭菌40min。冷却后接种，3132培养，待瓶内麸皮已结成饼时，进行扣瓶，继续

33、培养34d即成熟。要求成熟种曲孢子稠密、整齐。5.1.3 糖化曲制备（1）配料 称取一定量的麸皮，加入5%稻皮，加入原料量70%水，搅拌混匀。（2）蒸料 圆气蒸煮4060min。时间过短，料蒸不透对曲质量有影响；时间过长，麸皮易发黏。（3）接种 将蒸料冷却，打散结块，当料冷至40时，接入0.25%0.35%（按干料计）三角瓶种曲，搅拌均匀，将其平摊在灭过菌的瓷盘中，料厚为12cm。（4）前期管理 将接种好的料放入培养箱中培养，为防止水分蒸发过快，可在料面上覆盖灭菌纱布。这段时间为孢子膨胀发芽期，料醅不发热，控制温度30左右。810h，孢子已发芽，开始蔓延菌丝，控制品温3235。若温度过高，则水

34、分蒸发过快，影响菌丝生长。（5）中期管理 这时菌丝生长旺盛，呼吸作用较强，放热量大，品温迅速上升。应控制品温不超过3537。（6）后期管理 这阶段菌丝生长缓慢，故放出热量少，品温开始下降，应降低湿度，提高培养温度，将品温提高到3738，以利于水分排除。这是制曲很重要的排潮阶段，对酶的形成和成品曲的保存都很重要。出曲水分应控制在25%以下。总培养时间24h左右。（7）糖化曲感官鉴定 要求菌丝粗壮浓密，无干皮或“夹心”，没有怪味或酸味，曲呈米黄色，孢子尚未形成，有曲清香味，曲块结实。5.2 糖化酶活力测定5.2.1 浸出液的制备称取5.0g固体曲（干重），置入250mL烧杯中，加90mL水和10m

35、L pH值4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液，摇匀，于40水浴中保温1h，每隔5min搅拌1次。用脱脂棉过滤，滤液为5%固体曲浸出液。5.2.2 糖化液的制备吸取2%可溶性溶粉溶液25mL，置入50mL比色管中，于40水浴预热5min。准确加入5mL固体曲浸出液，摇匀，立即记下时间。于40水浴准确保温糖化1h。而后迅速加入0.1mol/L氢氧化钠溶液15mL，终止酶解反应。冷却至室温，用水定容至刻度，同时做一空白液。空白液制备：吸取2%可溶性淀粉25mL，置入50mL比色管中，行0.1mol/L氢氧化钠溶液15mL，然后准确加入5%固体曲浸出液5mL，40水溶中准确保温1h后用水定容至刻度。5.2.3

36、 葡萄糖测定空白液测定：吸取斐林试剂甲、乙液各5mL，置入150mL三角瓶中，加空白液5mL，并用滴定管预先加入适量的0.1%标准葡萄糖溶液，使后滴定时消耗0.1%标准葡萄糖溶液在1mL以内，加热至沸，立即用0.1%标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失，此滴定操作在1min内完成。糖化液测定：准确吸取5mL糖化液代替5mL空白液，其余操作同上。5.2.4 计算固体曲糖化酶活力定义：1g干重固体曲，40，pH值4.6，1h内水解可溶性淀粉为葡萄糖的毫克数。糖化酶活力=式中：V0为5mL空白液消耗0.1%标准葡萄糖溶液的体积，mL；V为5mL糖化液消耗0.1%标准葡萄糖溶液的体积，mL；c为标准葡萄糖溶液

37、的质量浓度，g/mL； 为5mL糖化液换算成50mL糖化液中的糖量，g； 为5mL浸出液换算成100mL浸出液中的糖量，g；W为干曲称取量，g；1000为g换算成mg。6 结果（1）记录制曲过程中观察到的现象。（2）酶活力测定结果列表记录。7 思考题（1）固体曲和液体曲相比，各有何优缺点？（2）糖化酶活力测定中应注意哪些因素？实验五综合实验：柠檬酸发酵及产物提取（一） 柠檬酸发酵一、实验原理柠檬酸发酵为典型的有机酸发酵，淀粉质原料经淀粉酶作用水解为葡萄糖，葡萄糖经EMP途径氧化为丙酮酸，丙酮酸进一步被氧化脱羟生成乙酰CoA，就一般能量代谢过程而言，生成的乙酰CoA与草酰乙酸缩合成柠檬酸后进入三

38、羟酸循环，通过三羟酸循环进行有氧呼吸的能量代谢。但就柠檬酸产生菌而言，由于其乌头酸流水作业事酶和异柠檬酸脱氢酶活性很低，而柠檬酸合成酶的活性很高，因而大量积累柠檬酸，草酰乙酸的提供则仍通过丙酮酸羧化而成，柠檬酸的生成途径如下式：国内目前柠檬酸发酵所采用的原料主要是山芋干及废糖蜜。二、实验器材（一）材料1菌种：黑曲霉Co8272液化酶92000u/g）3山芋干粉（二）主要仪器设备1旋转式摇床2显生镜三、操作步骤1种子培养基制备：称取山芋干粉100g、（NH4）2SO45g、液化酶0.2g，加水至1000ml，pH自然。分装后于121灭菌30min，三角瓶内装液量为20%。2种子液培养：将已灭菌的

39、种子培养基接入一环斜面或麸曲孢子于351、250r.p.m条件下培养2436h。3种子培养液质量要求：镜检菌丝生长健壮，结成菊花形小球，球直径不超过100m，每毫升含菌球数在12万之间，无异味、无杂菌污染；pH22.5；酸度1.52.0%。4发酵培养基制备：称取山芋干粉200g，加入0.2克液化酶，加水至1000ml，pH自然。分装后（装液量为20%）于121灭菌30min冷却备用。5发酵：将培养好的种子液按发酵培养液体积的10%接入到已灭菌的发酵培养基中，于351、250r.p.m条件下发酵45天。四、实验结果1对种子液进行镜检，画下菌丝形态，并测定菌球直径及粗略估算每ml种子液中的菌球数。

40、2测定成熟发酵液的酸度，并就发酵结束后的菌体形态作出描述。3计算柠檬酸发酵的转化率，即每100克葡萄糖经转化所能生成的柠檬酸克数，柠檬酸酵的理论转化率按下列反应计算应为106.7%。总反应式：2C6H12O6+3O22C6H8O7+4H2O2180 2192理论转化率=（二） 柠檬酸的提取柠檬酸钙的制备一、实验原理在成熟的柠檬发酵液中大部分是柠檬酸，但还含有部分山芋粉渣、菌丝体以及其它的代谢产物的杂质。柠檬酸的提取是柠檬酸生产中极为重要的工序，柠檬酸的提取方法有钙盐沉淀法、离子交换法、电渗折法及萃取法等，目前广泛用于国内生产的是钙盐沉淀法，其原理是利用柠檬酸与碳酸钙反应形成不溶性的柠檬酸钙而将

41、柠檬酸从发酵液中分离出来，并利和硫酸酸解从而获得柠檬酸粗液，经活性炭、离子交换树脂的脱色及脱盐，再经浓缩，结晶干燥等精制后获得柠檬酸成品，其中和及酸解反应式如下：中和：2C6H8O7H2O+3CaCO3Ca3（C6H5O7）24H2O+3CO2+H2O酸解：Ca3（C6H5O7）24H2O+3H2SO4+4H2O2C6H8O7H2O +3CaSO42H2O本实验以提取柠檬酸钙盐为主。二、实验器材（一）实验材料1柠檬酸发酵液、轻质碳酸钙（200目）、0.1429N氢氧化钠溶液、1%酚酞指示剂（二）仪器设备1制备式离心分离机、滴定管、烘箱三、实验步骤1发酵液预处理：将成熟的柠檬酸发酵液加热至80，

42、保温1020分钟，趁热进行离心分离，取滤液备用并记录滤液总体积。2发酵液总酸的测定：取滤液1ml，加5ml蒸馏水于洁净三角瓶人加入1滴酚酞指示剂用0.1429N NaoH滴定于初显红色为止，记下NaOH的消耗量。3中和：将发酵滤液加热至70，同时加入发酵液总酸量72%的轻质碳酸钙进行中和至pH 5.8，残酸0.2%0.3%，并于85条件下搅拌并保温30min。4离心及洗糖：将中和液趁热离心，倾去上清液后加入滤液总量1/2的80热水洗糖，再次离心所得固体即为柠檬酸钙盐。5将所得柠檬酸钙置于干燥洁净的表面皿中，于105烘干称重。四、实验结果1计算发酵液中总酸浓度及发酵所得的总酸量。2根据所得的钙盐

43、重量计算钙盐提取的提取收率。3简述发酵液预处理的意义及洗糖的目的。实验六酵母发酵力的测定（一）酒精酵母发酵力的测定一、目的要求掌握酵母发酵力的测定方法及表示法。二、实验原理酵母在微酸性糖液中起发酵作用，其中的糖逐渐减少，乙醇及CO2则依比例而增大，CO2是气体，除溶解于醪中者外，都跑向外面，所以测定酵母的发酵力，或测糖液比重的减小，或测糖的减少，或乙醇的增加，或称培器为减轻量，以CO2的失去多少，或用NaOH等固定CO2然后称其量，或将培养器密闭，由其中压力的增大，而定发酵的强弱等。以测醪的比重（Brix），可以算出发酵度（测量时前后温度要一致），则表现发酵度AP等于下式：可是发酵后的醪内有乙

44、醇，所以它的比重不能代表糖的残留量，前式算出的发酵度也因此加上“表现”二字。真正发酵度的计算法，是取发酵后的醪100毫升，蒸发至50毫升，将乙醇完全驱逐，用蒸馏水冲成100毫升，然后测定Brix度，以d示之，则真正发酵度酸度RP等于下式：称发酵瓶法，多用发酵栓（图）内盛稀释酸，吸收随CO2跑出的水汽。三、实验材料1菌种：酒精酵母及供试菌种。2培养基：15Brix麦芽汁300毫升。3试剂：5N左右的硫酸。4器具：Brix麦1支，无菌1毫升吸管，10毫升，吸管带发酵栓的250毫升发酵瓶，天平。四、方法步骤1将麦芽汁的比重，用Brix表测出，记入附表，然后分装入发酵瓶中，每瓶10毫升，加棉栓，另用油

45、纸包发酵栓，一齐杀菌0.6公斤/厘米220分钟。2麦芽汁冷至2030（勿）用表号，以手测之，贴标签，注明菌种及接种日期。将管中麦芽汁培养的酵母摇匀，用无菌吸管移1毫升于发酵瓶中，再用另一吸管移接到另一发酵瓶。3打开发酵栓的油纸，装于发酵瓶栓，用吸管装5N硫酸入发酵栓，以距离出气口管半厘米为度。4用于布将发酵瓶各部分抹干净，置瓶于粗天平上称量，记入附表，移瓶于25保温箱中，以后每天称量一次，均记入附表，以减轻量小于0.2克为止。5摇动二瓶，使CO2尽量逸去，然后打开，加水化成150毫升用Brix表测出比重，计算真正发酵度。6取发酵醪100毫升，蒸发去约一半，冷凉，加蒸馏水，冲成100毫升，测其B

46、rix，度计算真正发酵度。五、结果记录与思考题1将实验结果记录填入下表（甲）发酵瓶减轻量（CO2量）重量(克)菌种名称原重量第一天第二天第三天第四天第五天第六天第七天第八天第九天第十天总量减轻酒精酵母（乙）发酵度比重酒精酵母原麦芽汁（Bx）发酵后醪去乙醇后外观发酵度真正发酵度（%）酒精酵母（二）市售活性干酵母发酵力的测定二、目的要求掌握市售活性干酵母发酵力的测定方法。二、实验原理发酵力是酵母菌重要的应用特性之一。关于发酵力的测定，多用Meisse法或Hayduck氏法。前者为测CO2的重量法，其方法是：制好培养基（蔗糖4克，磷酸二氢钾0.22克，硫酸镁0.25克，装入带有发酵栓的瓶口，加压榨酵

47、母一克，称瓶重至30培养箱内5小时后再称瓶，减少之数，即为CO2量。以下式计算之：式中1.75系依麦塞尔（Missel）氏规定，1克纯酵母能发酵产生1.75克二氧化碳者，称为规定酵母，其发酵力为100。Nageli改良了Hayduck法，在发酵液中加入无机盐类，结果与实际制面包发酵结果相近。在400ml的发酵液中加压榨酵母10克，30温度下，2小时产生CO21000ml以上的为优良酵母，800至1000ml的为中等，800ml以下者为劣品。此方法适合于压榨酵母，固体酵母，活性干酵母发酵力的检测，同样适于酒曲发酵力的测定。三、材料1菌种：压榨酵母10克。2培养基：发酵液400毫升（40克蔗糖），

48、2克磷酸二氢钾，1克磷酸二氢铵，0.25克硫酸镁瘃0.2克硫酸钙）。3器具：测定设备一套，培养箱、天平、水浴（见图18-1）。四、操作步骤1发酵液置培养箱中一小时，使其温度达30，发酵器置于30水浴中，维持不变。图6-3 压榨酵母发酵力测定装置2将10克酵母加入发酵液中和匀，入发酵器的甲瓶中。记时间，连接管塞，酵母在甲瓶发酵所生CO2，经导管到乙瓶，排乙瓶的水入量筒，所以量筒内水的毫升数即等于甲瓶中所生CO2的毫升数。为免去乙瓶中水吸收CO2，可于水面加石油一层，使CO2与水不接触，或用食盐饱和水，减低CO2的溶解量。3六小时后，观察量筒中水的容量，将所生CO2的毫升数，或用0.03841乘，

49、得百克酵母所发酵的蔗糖的克数；用0.4乘，得百克酵母发酵葡萄糖的克数。五、结果记录与思考题1记录所生CO2毫升。2计算酵母发酵葡萄糖的克数。3请试推算一下发酵力的计算方法。实验七酒精发酵及酒曲中酵母菌的分离一、实验原理在无氧的培养条件下酵母菌利用已糖发酵为酒精和二氧化碳的过程，称为酒精发酵。总反应式为：C6H12O62C2H5OH+2CO2酒精发酵是生产酒精及各种酒类的基础，通过测定发酵过程中产生CO2和量和最终产物酒精的量可以得知酵母的发酵能力。酒曲中含有大量的微生物，其中有霉菌、酵母和细菌，在液体中，酵母生长比霉菌快，而酸性培养基酵母比细菌生长更适宜。因此，利用这一特性，可先将酒曲中的霉菌

50、与细菌数目减少，甚至消除（生理纯化法），然后用平板法分离酵母。此法较为简单。二、实验器材1蒸馏烧瓶、冷凝管、容量瓶、量筒、电炉、水浴锅、酒精灯、接种环、小刀、无菌平板、酒精度表（0%31%）、温度计（0100）。2酒曲、酿酒酵母（Shaccharomyces cerevisiae）、-淀粉酶。3麦芽汁培养基三、操作步骤（一）酒精发酵1酒母的培养（1）培养基的制备制取浓度为13BX的麦芽汁试管斜面培养基 将浓度为13BX的麦芽100ml，加入2g琼脂，融化后分装试管，121灭菌30min。液体试管培养基 将浓度为13BX的麦芽汁分装试管，121灭菌30min。三角瓶扩大培养基 将浓度为13BX的

51、麦芽汁分装500ml三角瓶，每瓶80ml，用3molL-1硫酸调节pH值至4.14.5，121灭菌30min。（2）接种与扩大培养 将酿酒酵母接种于试管斜面，2830培养48h，再将培养好的斜面接种1环于液体试管中，30培养24h，然后将液体酵母接种于三角瓶中，2830培养24h。（3）酒母质量检查 好的酒线应该形态整齐，细胞内原生质稠密，无空泡、无杂菌、细菌数达0.81.0亿/ml，出芽率17%20%，死亡率小于2%。2淀粉的液化与糖化（1）按13.5的山芋粉和水的比例，用80的温水调粉浆100ml，加入0.1%-淀粉酶（调匀后浆液的温度应高于65）于水浴加热到9093，保持10min，并继

52、续加热煮沸1h，不断补充水分。（2）将上述认化醪冷至6062加入10%麸曲，糖化30min，分装三角瓶，每瓶量为400ml。（3）糖化醪质量检查 要求糖度1617BX，还原糖4%6%，酸度23。3发酵 将培养好的酒母用无菌操作接入盛有400ml糖化醪的发酵瓶中，30培养6872h。4生成CO2量的测定 酒精发酵测CO2产生量（失重量）的装置如图1所示。（1）培养前，揩干三角瓶外壁，置于百分之一的天平上称量，记下重量为W1。（2）培养完毕后，取出三角瓶轻轻摇动，使CO2尽量逸出，在同一架天平上称重，记下重量为W2。（3）二氧化碳重量=W1-W25酒精度的测定（1）酒精生成的检验 嗅闻有无酒精气味

53、；或取发酵液少许于试管中并滴加1%K2Cr2O7溶液，如管内由橙色变为黄绿色，则证明有酒精生成。（2）按图2装好蒸馏装置。图1 酒精发酵测二氧化碳产生量的装置 图2 酒精发酵醪蒸馏酒精装置1.安全回流管 2.蒸馏瓶 3.冷凝管4.石棉板 5.电炉 6.铁架（3）准确量取100ml发酵液于500ml蒸馏瓶中，同时加入等量的蒸馏水。连接好冷凝器，勿使漏气，用电炉加热，馏了液收集于100ml容量瓶中。待馏出液达到刻度时，立即取出容量瓶摇匀，然后倒入100ml量筒中，以酒精表与温度计同时插入量筒，测定酒精度和温度，最后换算成20时酒精度。（二）酒曲中酵母菌的分离1配制培养基（1）酸性蔗糖豆芽汁（加乳酸

54、0.5%）培养液分装试管，灭菌。（2）蔗糖豆芽汁琼脂，分装试管和三角瓶，灭菌。2分离（1）用灭菌过的小刀，割开曲块，挖其中米粒大小1块投入酸性培养液中，摇动后将该管置于25培养箱中培养，两天后转到另一管酸性培养液中，见到霉菌丝球即行剔除。然后每隔两日转接一次，一周后分离。（2）最后将转接试管酸性培养液中的酵母直接用稀释平板法进行分离，培养后，分别移植单独的酵母菌落于蔗糖豆芽汁斜面上，贴上标签，标明菌株编号以及移植日期，置于培养箱中培养，待长出、分纯后即可进行鉴定。四、实验结果1比较酒精生成量及CO2生成量之间的关系。2发酵培养基液化、糖化及调节pH的目的、意义？实验八酵母忍耐酒精浓度的测定二、目的要求掌握和理解测定酵母耐酒精浓度