（医学课件）1,3-β-D-葡聚糖检验简介.ppt

1、1,真菌（1-3）-D-葡聚糖与革兰氏阴性菌脂多糖检测,2,鲎,20世纪六十年代，人们发现一种古老的海洋生物，被称为“海洋活化石”的鲎，它的血液与内毒素接触后会发生特异性的凝集反应，人们经过大量研究和实验从它的血液中提取出了用来检测内毒素的“鲎试剂,3,鲎试剂的发明,1981年1月Jack Levin和 Frederik B.Bang教授在美国马塞诸塞州Wools Hole海洋生物实验室成功分离提取鲎血细胞并研制成能够检测细菌内毒素的鲎试剂，开辟了人类认识和检测内毒素的新纪元,4,侵袭性真菌感染率上升,5,严重真菌感染迅速上升势头,危重病人的存活期延长,延长了真菌感染的 高 危 期,使此类患者

2、业已增加的人数进一步扩大,医学和相关科学的进步,是日益严重的威胁,6,真菌感染的危险因素,中心静脉插管 尿道插管 广谱抗生素 气管插管 腹部外科 肠胃外营养 营养不良 住院时间,感染之前定殖,7,侵袭性真菌感染,条件致病性真菌 念珠菌病 曲霉病 隐球菌病 其他,8,诊断方法,影像学 组织病理学/细胞学 培养 血清学 分子生物学方法： Platelia Aspergillus ELISA Fungitell assay PCR（unavailable,传统的方法,9,真菌病实验室诊断主要内容,准确、快速检出真菌病原体 真菌镜检 真菌培养 组织病理 生理生化 血清学方法 分子生物学,10,镜检和培

3、养方法,敏感性低 血培养：在肿瘤和血液病病人中，50%尸检证实深部念珠菌感染的病例血培养阴性。 培养结果阳性仅表示存在某种真菌，区分定植和感染困难 培养时间长 有些标本采集困难,11,非培养方法优点,快速报告结果 敏感性提高 取材简便 多以真菌在致病状态产生的物质为检测标志物，结果阳性提示有致病性 定量检测可判断感染严重程度及疗效评估,12,非培养诊断的方法简介,真菌细胞壁成分 （1-3） - - D-葡聚糖检测（G试验） 真菌抗原检查 半乳甘露聚糖（galactomannan) 抗原（GM) 甘露聚糖(mannan)抗原 隐球菌荚膜多糖抗原（乳胶凝集试验） 真菌特异的代谢产物 D-阿拉伯糖醇

4、 真菌 DNA 的检测,13,临床诊断、拟诊的微生物学,1 合格痰标本直接镜检发现菌丝，且连续培养2次分离到同种真菌 2 BALF经直接镜检发现菌丝真菌培养阳性 3 痰液或BALF直接镜检发现新生隐球菌 4 乳胶凝集法检测隐球菌荚膜多糖抗原阳性 5 G实验连续两次阳性 6 GM实验连续两次阳性,14,侵袭性真菌感染的诊断标准EORTC/MSG2008修订版,宿主因素 临床特征 病原学 真菌镜检 真菌培养 组织病理学检查 血清学检查方法（间接证据） CSF隐球菌抗原阳性确诊 GM-test, G-test临床诊断,Clinical Infectious Diseases 2008; 46,15,

5、注：原发性者可无宿主因素，肺组织、胸液、血液真菌培养阳性（除外肺孢子菌,诊断IPFI的三个级别,16,1,3） - - D-葡聚糖检测,17,1,3,真菌细胞膜、壁结构,羊毛固醇C14去甲基化酶 14位还原和78位异构酶 角鲨烯环氧化酶,18,1,3-D-葡聚糖结构,葡聚糖广泛存在于真菌细胞壁中 1,3-D-葡聚糖占真菌壁成分50%以上，是真菌细胞壁上的特有成分 以1,3-糖苷键连接的葡萄糖残基骨架作为主链 以分支状1-6-D葡萄糖残基作为侧链,19,1,3-D-葡聚糖特性,对热极为稳定，高压121并不能使其灭活。在念珠菌和曲霉菌细胞壁中含量较多，对G实验灵敏。 当真菌进入人体血液或深部组织后

6、，经吞噬细胞的吞噬、消化等处理后，(1-3)-D-葡聚糖可从胞壁中释放出来，从而使血液及其它体液中含量增高。当真菌在体内含量减少时，机体免疫系统可将其清除。 在浅部真菌感染中，(1-3)-D-葡聚糖未被释放出来，故其在体液中的量不增高。 可用于检测念珠菌、毛孢子菌、曲霉菌、镰刀菌、卡氏肺孢子菌 不可检测隐球菌、接合菌（根霉/毛霉等,20,G”试验缘何而来,21,405nm测光度值,pNA（对硝基苯胺，黄色,AC-Ile-Glu-Ala-Arg-OH,AC-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA（酶作用物,凝固酶,凝固酶原,活化B因子,B因子,活化C因子,C因子,内毒素,凝固蛋白原,凝固蛋白（凝

7、胶,G因子,活化G因子,葡聚糖或LAL-RM,凝胶法、比浊法,显色法,旁路反应,检测原理（比色法,22,分析前注意事项,采用无热原采血管 抽血后2h内送检 血标本4-8最多存放48h 检测环境应保持清洁,23,1,3-D-葡聚糖相关影响因素,以下情况可出现假阳性： 使用纤维素膜进行血透，标本或患者暴露于纱布或其他含有葡聚糖的材料； 静脉输注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或血液制品； 链球菌血症； 操作者处理标本时存在污染； 使用多糖类抗癌药物、放化疗造成的粘膜损伤导致食物中的葡聚糖或定植的念珠菌经胃肠道进入血液等也可能造成假阳性,24,1,3-D-葡聚糖检测临床价值,早期诊断：侵袭性真菌感染增多

8、且复杂，早期症状无特异性，往往被原发病掩盖，病程长，发现较晚，死亡率高。因此对深部真菌感染治疗成败的关键在于早期诊断。 指导用药：快速确定真菌感染后，选择好治疗方案,有针对性使用抗真菌类药物。为临床选用副作用小，疗效高，价格适宜的药物提供准确的依据。 评价效果：应用抗真菌药物后，定期检测血浆中葡聚糖浓度变化，评价选用药物的有效性。 监护病程：监护深部真菌感染易感人群的病发状态。 动态观察：易感人群，监测临床疗效,25,曲霉菌半乳甘露聚糖（GM,Figure 1-10 Noncompetitive sandwich method of immunoassay,26,中性粒细胞减少症患者40例 （

9、发展为曲霉菌病的高危人群） 该研究选择1,3-D-葡聚糖（BG）和半乳甘露聚糖（GM）两个指标 用于监测中性粒细胞减少性成人曲霉菌病患者 BG和GM两项指标均可用于指导临床诊断和治疗真菌性疾病, 但BG可早于GM升高. BG和GM联合检测用于曲霉菌病的诊疗, 其特异性和阳性率均为100,例 1,Carmen Pazos, Jose Ponton, etc. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY,Jan.2005,结论： BG和GM联合检测有助于临床鉴定血液病患者是否合并真菌感染, 并将单一试验假阳性给诊疗带来的影响降低到最小,1,3-D-葡聚糖与循环半乳甘露聚糖的检

10、测比较： 用于治疗和监测中性粒细胞减少性成人曲霉菌病,27,120名儿童 7月8岁 1,3-D-葡聚糖定量检测结果： 中位数 32 pg/ml 平均值 68128 pg/ml 高值 5例 12岁 348 pg/ml 2岁 374 pg/ml 14岁 491 pg/ml 13岁 754 pg/ml 14岁 947 pg/ml 94例(78%) 180pg/ml,例 2,P.Brian Smith, Daniel K.Benjamin,Jr, etc. CLINICALAND VACCINE IMMUNOLOGY,July2007,结论 研究数据显示, 健康儿童的1,3-D-葡聚糖水平高于健康成人

11、 . 该指标用于儿童感染性疾病的诊断应慎重, 1,3-D-葡聚糖在儿童群体的正常值区间有待进一步研究,儿童1,3-D-葡聚糖水平研究,28,非免疫功能低下儿童1,3-D-葡聚糖水平,29,血浆1,3-D葡聚糖检测对血液病患者侵袭性真菌感染的诊断价值,本研究收集疑为IFI的血液病患者血浆标本162例,其中化疗后患者85例,造血干细胞移植后患者77例。 按照欧洲癌症研究治疗组织及真菌研究组(EORTC/MSG)诊断标准,所有病例中有确定诊断2例,临床诊断18例,拟诊75例,排除诊断67例。 结果表明:以20 ng/m l为诊断界值,G试验的敏感性、特异性、阳性预测值(PPV)和阴性预测值(NPV)

12、分别为75%、91%、72.4%和92.4,例 3,刘芳,吴彤,等. 中国实验血液学杂志Journal of Experimental Hematology 2009,30,在所有162例患者中,若无G试验作为诊断标准,仅20例患者达到确诊+临床诊断真菌感染标准,占总病例数12.3%。 若将G试验阳性作为微生物学标准,则有71例达确诊+临床诊断标准,占总病例数的43.8%。 在75例拟诊病例中,其中51例真菌培养阴性而G试验阳性的患者,均对广谱抗生素无效而经过抗真菌治疗病情好转,经过临床回顾性分析符合IFI,故G试验使IFI诊断率提高了31.4,G试验对IF I诊断率的影响,31,小结,1,3

13、-D-葡聚糖是侵袭性真菌感染早期诊断、疗效观察、预后评估有价值的实验诊断。 1,3-D-葡聚糖检验其敏感性优于GM 侵袭性真菌感染的诊断与治疗是一个复杂过程，实验室与临床应密切联系，为临床医生提供诸如显微镜检查、真菌培养、血清学标志物等多方面信息,32,内毒素定量检测,Bacteria Endotoxin Test,33,检验科医生关注的问题,临床的需求情况； 检测的临床意义以及和微生物培养的对比关系； 临床临检的操作难易度； 仪器、试剂的价格和交易方式； 检测项目是否有收费标准； 检测方法学的科学性如何； 试剂的稳定性和重复性； 后续服务,34,临床医生关注的问题,检测的临床意义； 如何正确

14、理解这些临床意义； 与微生物培养以及PCT的对比关系； BET的适应症和分段区间解释； BET测得值的影响因素有哪些,35,前言,1892年,科学家Richard在研究霍乱弧菌的时候,发现革兰阴性菌细胞壁外膜中有一种不溶性成分,它能够引起人体发热、休克、器官损害等病理表现，因其毒性效应和性质与外毒素有显著差异，就用内毒素这一术语来描述该物质。随后多年对革兰阴性菌细胞壁外膜的超微结构技术和生物分析技术，证实内毒素是磷脂双分子层结构,36,革兰阴性菌脂多糖（LPS）电镜下结构示意图,O特异性抗原,核心多糖,脂质A,37,内毒素的定义和危害,内毒素（Endotoxin）是革兰阴性菌细胞壁外膜的脂多糖

15、（LPS）成分，是革兰阴性菌生长时释放或死亡后裂解出来的毒性产物，其中起主要致病作用的是非结合的游离脂多糖（FLPS）。 内毒素能够直接作用于人体，激活组织内的炎性细胞和炎症因子，导致机体发热并产生全身性炎症反应（SIRS），继而引起弥散性血管内凝血、休克、多脏器功能衰竭等严重的病理生理症状，危及生命，由于内毒素与革兰阴性菌关系密切，所以内毒素血症在临床非常常见,38,内毒素的理化性质,耐热性：彻底灭活需250高温干烤一小时 可滤过性：能够穿透滤过膜 水溶性：LPS的O-特异性Ag呈亲水性 被吸附性：可被活性碳所吸附 易被强酸、强碱和强氧化剂破坏 不挥发性：加热时，不随水蒸气挥发,39,40,

16、人体内毒素的来源,外源性途径,内源性途径,休克,大手术术后,感染,注射药品 及溶液,开放性创伤,烧伤,骨折,肝脏疾病,外 内,内毒素来源,41,内毒素定量检测的临床意义,发热原因的快速辅助诊断（ 1小时）； 早期判断革兰阴性菌的感染情况； （G菌所致）脓毒症、MODS等重症疾患的早期诊断 帮助临床医生快速合理筛选适当的药物(抗生素)； 判断抗感染治疗效果及预后； 肠源性内毒素血症的预判及评估； （G：革兰染色；MODS:多脏器功能衰竭,42,肠源性内毒素血症,应激：应激（stress）是指机体在受到各种强烈因素（即应激原）剌激时所出现的以交感神经兴奋和垂体-肾上腺皮质分泌增多为主的一系列神经内

17、分泌反应以及由此而引起的各种机能和代谢的改变。 各类致病因素 人体处于应激状态 肠道屏障功能减弱 下消化道通透性增强 内毒素进入肠道周围淋巴结 经淋巴管进入肝脏 超出肝脏能够解毒、过滤的范围 体循环 内毒素血症 发热、炎症,43,为什么BET能有助于诊断不明原因发热,发热是人体为适应外界环境变化而产生的一种以体温升高为表现的生理征象，在生活中和临床上非常常见，从来源上可分为内源性和外源性两大方面，但无论是哪种长时间的发热都对人体有害，因此在临床上快速明确病因给予及时妥善治疗并使体温恢复正常是所有医生的工作重点。 而临床上最常见的发热是病原微生物引起的发热，内毒素别名热原，能够直接作用于体温调节

18、中枢导致人体发热，而内毒素的主要来源是由革兰阴性菌死亡后释放出来，况且不论哪种因素引起的感染，均会引起人体免疫屏障功能降低，继而使得肠道屏障被破坏，最终导致内毒素或其他病原微生物从肠道进入体循环血液，因此通过测得血中内毒素的值，不仅可直接明确导致人体发热的血液中内毒素量的多少，而且还间接判断了革兰阴性菌和革兰阳性菌的感染情况，因此得以诊断不明原因发热,44,如何理解内毒素定量检测能够早期判断革兰阴性菌的感染情况,内毒素是由革兰阴性菌在生长时少量释放、死亡后大量崩解的一种脂多糖成分，其中G-菌脂多糖毒力核心是其三种组成成分中的脂质A，脂多糖脂质A 只有游离出G-菌才能发挥其毒性作用，因此内毒素的

19、多寡大致可与革兰阴性菌成正相关，由于人体免疫系统的存在及临床抗生素的使用导致革兰阴性菌被杀灭，释放出内毒素，因此通过定量检测内毒素，可以早期判断G-菌的感染情况，为临床的早期治疗提供诊断依据,45,如何理解内毒素可以作为脓毒症、MODS等重症疾患的早期预判指标,内毒素的危害主要是激活多种炎性细胞和补体最有效的一种物质，并能引起SIRS、DIC、SHOCK、MODS，而这些病理疾患往往非常不易在早期被发现，而且一旦罹患则很难被短时间内治愈，并对人体各脏器系统造成极大的危害，所以，只要内毒素存在，患者的病情就很有可能发展并演变成为SIRS、DIC、SHOCK、MODS，因此，早期诊断、早期治疗这些

20、疾患在临床上就显得十分重要，且这一点容易被临床医生所忽视，所以，可以把血液中内毒素水平作为SIRS、DIC、SHOCK、MODS等临床常见重症疾患的早期预判指标。 脓毒症= 全身炎症反应综合症SIRS+革兰阴性菌感染G,46,BET如何帮助临床医生快速筛选适当的药物并合理使用抗生素,临床医生往往通过患者的发热症状、体征、血常规、微生物培养药敏试验及其它影像学材料来综合考虑合理使用抗生素，但始自20世纪90年代中期开始，国内外的一些专家通过多次体外试验和临床观察中证明抗生素有诱发内毒素释放的作用。例如：不同类抗生素诱发内毒素的释放量存在着差异，以抗革兰阴性杆菌的临床常用的四种抗生素为例,47,抗

21、生素与内毒素释放,头孢他定（头孢菌素类）培福新（奎诺酮类）依米配能（碳氢霉烯类）阿米卡星（氨基糖甙类），即以上四种抗生素都能杀灭革兰阴性菌，但在菌量下降的同时上清液中的游离内毒素值却是交叉样的上升，其中以头孢他啶引起内毒素释放最为明显。 因此，一旦检测出内毒素超标，就提示临床医生必须注意应选用既有杀菌作用又尽量不引起内毒素释放的抗菌药物，内毒素定量检测以此来帮助临床医生快速筛选适当的药物，特别是指导临床合理使用抗生素,48,内毒素定量检测如何做到评价临床治疗的目的,内毒素已被国内外专家公认为是激活并产生多种（炎性）细胞和补体最有效的一种物质，而对于人体而言，器官损害的程度与病情的轻重几乎与各种

22、炎性介质释放的多少成正比，由此可以分析：循环血中内毒素值越低，炎性介质释放得越少，器官损害越弱，病情越轻；给予治疗的同时复查内毒素，就能判断临床治疗效果的好坏,49,内毒素检测结果的临床意义分析,00.05EU/ml 正常 无明显内毒素血症，尚不足以说明此时的内毒素测得值与革兰阴性菌感染及或脓毒症有必然的联系； 0.05 0.1EU/ml 轻、中度内毒素血症 轻、中度内毒素血症，此时的内毒素测得值可被视为是革兰阴性菌感染的轻度期或恢复期，及或脓毒症的轻度时期或恢复期，应给予重视，建议每24小时动态检测一次，治疗上可对症处理； 大于0.1 EU/ml 重度内毒素血症 重度内毒素血症，此时的内毒素

23、测得值可被视为是严重革兰阴性菌感染时分泌或死亡后大量释放，及或脓毒症的危重期，极易发生内毒素的“瀑布式反应”，建议每8小时动态检测一次，治疗同上，同时应考虑是否更换抗生素及改变抗生素使用的方式和剂量,50,内毒素在人体血液当中的主要影响因素,外源性的内毒素侵入 患者肝功能 血循环系统当中以单核-巨噬细胞系统、血管内皮细胞系统为代表的微血管功能体系及免疫系统 患者肠道的屏障功能 革兰阴性菌感染以及使用抗生素杀灭G菌后对内毒素的释放,51,检测内毒素的方法,定性检测 凝胶法,定量检测 光度（浊度）法 动态浊度法 终点浊度法 显色（比色）法 动态显色法 终点显色法,52,几种检测方法的比较,凝胶法检

24、测的特点 “限量”检测，是一种传统经典的检测方法； 凝胶法是以试管内反应物凝胶牢固程度为判断标准，易受人为因素影响； 限量检查的最低检测限仅为0.03EU/ml，因供试品稀释倍数所限，容易被供试品干扰，误差大。因此，凝胶法不适合在临床用于体液的细菌内毒素检查,显色法检测的特点 使用人工合成鲎三肽作为显色基质，细菌内毒素与鲎试剂中C因子 系反应所激活的凝固酶能使水解合成肽中的 精氨酸肽链释放出游离的对硝基苯胺显色，通过测量反应液中的吸光度值而进行定量分析的一种检测方法。 此法试剂较昂贵，操作较复杂，在一定范围之内灵敏度、特异性较高，但检测范围窄,53,动态浊度法检测的特点,利用细菌内毒素在与鲎试

25、剂形成凝胶过程中浊度动态变化定量测定细菌内毒素水平 ； 动态浊度法法检测范围宽，检测范围为 0.005EU/ml 100EU/ml，应用范围广； 对样本的内毒素含量可以定量检测，标准化程度高，适合用于临床体液细菌内毒素引起发热及重症疾病的早期诊断检测,54,内毒素定量检测系统的质控,目标值 实测平行对照值 （EU/ml/ 时间s） 0.5EU/ml 0.4689/ 1211s 0.4741/ 1208s 方法：用已知的内毒素国家标准品与鲎试剂反应，如果不同梯度的目标值与实测值在可允许的范围之内，表示质控良好（国家规定内毒素测得值标准误差在15,55,7例内毒素与血培养的结果比较,科室 内毒素结

26、果(EU/ml) 血培养结果 脑外科 0.4808 大肠埃希菌 ICU 0.2136 大肠埃希菌 ICU 0.5904 鲍曼不动杆菌 ICU 0.1408 鲍曼不动杆菌 肾内科 13.4727 大肠埃希菌 肝移植科 2.1 大肠埃希菌 肝移植科 16.8792 大肠埃希菌 内毒素超标,血培养阳性,56,8例内毒素与痰培养的结果比较,科室 内毒素结果(EU/ml) 痰培养结果 脑外科 3.0096 肺炎克雷伯菌、 鲍曼不动杆菌 脑外科 3.2064 肺炎克雷伯菌 脑外科 17.0976 肺炎克雷伯菌 脑外科 11.2776 铜绿假单胞菌、 鲍曼不动杆菌 肾内科 1.8264 肺炎克雷伯菌、 铜绿

27、假单胞菌 肝移植科 2.79 鲍曼不动杆菌 肾移植科 10.204 阴沟肠杆菌 ICU 8.0672 大肠埃希菌,57,内毒素检测与微生物培养的关系,内毒素检测 微生物培养 确定菌种 菌种确定 精确确定 指导用药 检测速度 1h 快 较慢 评估病情轻重 重疾早期预警,58,内毒素定量检测的适应症,各种急、慢性病理性发热患者 各种类型“中重度感染、肝病、休克、肠道疾病、脏器功能衰竭、大手术术后”患者 慢性疾病长期卧床、免疫力低下患者 急诊及ICU病房收治的生命体征不稳定的患者,59,BET体液标本范围,血液 尿液 胸腔积液 腹腔积液 脑脊液,60,内毒素血症的预防和治疗,针对病原菌合理使用敏感抗生素 尽量避免、减少肠源性内毒素血症的发生，针对不同原发疾病的患者可分别给予不同方式治疗，如早期肠道营养、保护肠道粘膜（如谷氨酰胺）、促进排便（如乳果糖、导泻剂、中药大黄等） 拮抗内毒素治疗，如内毒素单克隆抗体、血浆置换疗法