枯草芽孢杆菌营养缺陷型突变株的筛选

1、题目：细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选鉴定一、实验原理：筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、营养缺陷性的浓缩、检出、鉴定缺陷型。本实验选用亚硝酸钠为诱变剂来诱发突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，最后经生长谱法鉴定细菌的营养缺陷型。二、实验器材：离心机，冰箱，恒温箱，高压灭菌锅；接种针，三角烧瓶，试管，离心管，移液管，培养皿，枪头三、菌种：大肠杆菌四、所有用到的培养基：（分别列出配方）1. LB培养液：酵母膏，0.5g；蛋白胨，1g；NaCl，0.5g；水，100ml，pH7.2 121灭菌15min 2. 基本培养基： 葡萄糖 0.5 g，(NH4)2SO4 0.1

2、g，柠檬酸钠 0.1 g，MgSO47H2O 0.02 g，K2HPO4 0.4 g，KH2PO4 0.6 g，重蒸水 100 mL，pH 7.2，110灭菌 20 min。 配固体培养基时需加 2%洗涤处理过的琼脂。全部药品需用分析纯，使用的器皿 需用蒸馏水或重蒸水冲洗 23 次。3. 无N基本液体培养基： K2HPO4,0.7g；KH2PO4,0.3g; 柠檬酸钠 3H2O,0.5g；MgSO4 7H2O,0.01g; 葡萄糖2g；水100ml，pH7.0 110灭菌20min4. 2N基本培养基：K2HPO4,0.7g；KH2PO4,0.3g; 柠檬酸钠 3H2O,0.5g；MgSO4

3、7H2O,0.01g; (NH4)2SO4,0.2g;葡萄糖2g；水100ml，pH7.0 110灭菌20min5. 完全培养基同LB培养基，配置固体培养基，需加 2%的琼脂。6. 补充培养基(简称SM)：为满足某特定营养缺陷型菌株的营养要求而在基本培养基中加入某种或几种营养成分的培养基称补充培养基。7.醋酸缓冲液(pH4.5)（ 取醋酸钠18g,加冰醋酸9.8ml,再加水稀释至1000ml）、0.1 mol/L亚硝酸钠溶液(68.9950.1=6.8995g/L)、0.07 mol/L酸氢二钠溶液(pH8.6)(141.960.07=9.9372g/L)五、实验步骤1th day: 各种所需

4、培养基、试剂的配制及所需器材灭菌2th day：菌体活化与培养：取一环E.coli于5mlLB液体三角瓶中，37培养过夜，1416h.3th day：早上添加5mlLB液，充分混匀后，分装到两只三角瓶，继续培养5小时。将两瓶菌液分别倒入离心管中，离心（3500rpm）10分钟，弃上清，其中一管加生理盐水5ml，打匀沉淀，然后倒入另一离心管中，两管合并成一管。（菌体密度控制在 10*710*8个/mL）。LB液体10ml、生理盐水、两个100ml三角瓶、5ml离心管*2、 菌液浓度测定比浊计数法（OD600=1,枯草芽孢杆菌浓度为610*个/mL）。亚硝酸钠(NIT)诱变:取菌悬液1mL、醋酸缓

5、冲液(pH4.5) 2 mL、0.1 mol/L亚硝酸钠溶液1 mL,于26摄氏度下保温25 min后每个样中,加入0.07 mol/L磷酸氢二钠溶液(pH8.6)20 mL,以终止反应。然后取诱变菌液 1 mL 稀释涂布于LB琼脂平板上，在 30 下培养 48 h 后进行菌落计数，计算致死率.无菌水20ml、平皿15个、300mlLB固体、10ml移液管、醋酸缓冲液(pH4.5)（三）营养缺陷型浓缩（淘汰野生型）3th day：延迟处理：吸菌液5ml于离心管中，3500rpm离心10min，弃上清。离心洗涤两次（加生理盐水至原体积，打匀沉淀，离心，弃上清，重复一次），最后加生理盐水制成5ml

6、菌悬液。取0.1ml菌液于5ml无N培养基中，10ml无N、100ml 三角瓶、枪头、5ml离心管37培养12h。4th day：初筛：加入等体积2N基本培养液5ml，加5万U/ml青霉素钠盐溶液100ul(1 国际单位（IU） = 0.60g 结晶青霉素G钠盐 0.625g 结晶青霉素G钾盐 )，使青霉素在溶液中的最终浓度约为500U/ml(青霉素母液过滤除菌后加入），再放入37培养。2N基本培养液10ml、5万U/ml青霉素钠盐溶液（四）营养缺陷型检出5th day：从培养12、16、22小时（根据实际情况，选择2-3个时间段）的菌液中分别取0.1ml菌液到基本及完全培养基两个培养皿中，涂

7、布，37培养。7th day：检出营养缺陷型。上述平板培养3648h后，进行菌落计数。基本及完全培养基各200ml、平皿18个（五）复证：选取完全培养基上长的菌落数大大超过基本培养基的那一组，用灭菌牙签挑取完全培养基上长出的 菌落100个分别点种于基本培养基和完全培养基上（先基本，后完全），37培养。9th day：选在基本培养基上不长，完全培养基上生长的菌落在基本培养基上划线，37培养24h，仍不长的是营养缺陷型。基本、完全、平皿待定(六) 生长谱测定使用以下四种营养物质：a. 不含维生素的酪素水解液或氨基酸混合液酪素水解液的配制：1g干酪素溶于碱性缓冲液(Tris-HCl、PBS)中，加入

8、1%的枯草芽孢杆菌蛋白酶25mL加水至100mL, 30水解lh。（用于配制培养基时，其用量为1000mL培养基中加入100mL以上水解液。）b. 维生素混合液c. 0.1%碱水解酵母核酸液d. 酵母浸出物10th day：生长谱的测定：将检出的营养缺陷型菌落接种于5ml LB液试管中，37培养1416h。11th day：培养16h的菌液离心。3500rpm，10min，弃上清，加生理盐水，打匀沉淀，再次离心。加5ml生理盐水制成菌悬液。取其1ml于培养皿中，加入融化后冷却到4050的基本培养基，混匀，平放，共二皿。（平板表面分别沾上沾有以上四种营养物质的滤纸片，30培养 24h，经培养后营养物质周围有生长圈，即表