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文档简介

1、SDS-PAGE电泳实验过程,1. 准备玻璃板：将玻璃板用蒸馏水洗净晾干(实验室前后的空调吹干)，把玻璃板在灌胶支架上固定好（固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板，方向）。准备2个干净的100ml的烧杯；2. 配制分离胶：按比例（见SDS-PAGE 各部分凝胶配制）配好分离胶，用1ml移液器将胶液快速加入到玻璃板的夹缝中，注胶量约3ml，高度约5厘米（加至板夹上沿），之后迅速加少许去离子水至满，静置30分钟。凝胶配制过程要迅速，促进剂TEMED要在注胶前再加入，否则凝结无法注胶。注胶过程一次性完成，避免产生气泡,水封的目的是为了使分离胶上沿表面平直，并排除气泡 凝胶聚合好的标志是胶

2、与水层之间形成清晰的界面.3.制备浓缩胶：倒出分离胶上面的水，并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例（见SDS-PAGE 各部分凝胶配制）配好浓缩胶，连续平稳加入浓缩胶至满,立刻插入样梳，静置30分钟. 样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平.4.玻璃胶板的安装：将玻璃胶板固定到上样槽上，加入电极缓冲液，内槽距离顶端约5mm，没过短板，确保不漏液后拔出样梳。 要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果. 5.加样（详见7,SDS-PAGE-各部分凝胶配制,6、样品预处理： 低分子量蛋白Mark,E1,E2,E3,E4,牛血清白蛋白。 （1）低分子量蛋白Mark、牛血清白蛋白和E4的样品

3、由实验室提供。 （2）E1,E2,E3,E4分别取20l，再加入20l 2倍(2X)样品缓冲液，在沸水中煮3分钟(本次实验1个E3、E4-1和E4-2由实验室提供)，点动离心除沉淀。 7、加样：用移液器向电泳道中加样，进样枪头要抵到泳道表面，但是不要刺破胶的表面，进样要缓慢，不要使样品漂出泳道外面,1,10,8. 电泳过程：将上样槽装入电泳槽，向电泳槽中加入电极缓冲液，接通电源，进行电泳。开始电流恒定在10mA（如果同时电泳两块胶，电流恒定在20mA ），当样品在分离胶与浓缩胶之间被压成一条直线的时候，将电流改为20mA （如果同时电泳两块胶，电流恒定在40mA ） ，电压设定在220V。溴酚蓝距凝胶下边缘约5mm时，停止电泳。 9. 凝胶板剥离与染色：电泳结束后，将上样槽的电极缓冲液倒入特定容器，取下电泳胶玻璃板，用楔形工具小心将玻璃板撬开，将凝胶做好标记，切除浓缩胶并冲洗后放在大培养皿内，加入染色液，染色1小时。 10. 脱色：回收染色液，凝胶板先用水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。确定目的蛋白条带位置，估算分子量，比较不同纯化过程对杂蛋白去除状况。 剥胶时要小心，保持胶完好无损，染色要充分,低分子量标准蛋白试剂盒,低分子量标准蛋白： 兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白 MW=66,200 兔肌动蛋白 MW=43,000

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