实验报告细胞色素C的提取

1、实验报告细胞色素C的提取一、 实验目的1、 熟悉细胞色素C提取与检测方法；2、 掌握吸附、盐析、透析等实验技术。二、 实验原理细胞色素C是以一种铁卟啉为辅基的呼吸酶，广泛存在于所有的需氧组织中。在心肌与其他做剧烈运动的肌肉中含量最为丰富。细胞色素C位于线粒体的蛋白质脂质络合物中，分子量约为13000，肽链中含有19个赖氨酸残基，为一碱性蛋白, 等电点（10.510.8）高、易溶于酸性溶液, 故采用酸化水提取。人造沸石为铝酸钠，它是一种阳离子交换剂，细胞色素C分子刚好进入它的表面空隙。在pH7.5时细胞色素C 呈正电荷，它可与沸石分子上的钠离子发生交换，从而被沸石吸附。装入层析柱后，用25%硫酸

2、铵洗脱，又可将细胞色素C 交换下来。硫酸铵主要是降低沸石对细胞色素C 的亲和力。硫酸铵盐析可明显提高细胞色素C 纯度，主要为去除杂蛋白。另外三氯乙酸可引起细胞色素C 变性和聚合，必须严格控制三氯乙酸用量。三、 实验仪器设备与材料试剂1、 设备：组织捣碎机、酸度计、离心机、分光光度计、层析柱、透析袋、磁力搅拌器、冰箱2、 仪器：剪刀、烧杯、漏斗、滤纸、天平、玻璃棒、纱布、试管、胶头滴管3、 试剂：联二亚硫酸钠、硫酸、硫酸铵、三氯乙酸、人造沸石、氯化钡、氯化钠、氢氧化铵4、 材料：新鲜猪心（2个）四、 实验技术路线 预处理 水、硫酸、PH3.4新鲜猪心 匀浆 提取液氨水、pH6.0、过滤 氨水、p

3、H7.5、过滤 滤液 人造沸石 水、氯化钠、硫酸铵 硫酸铵盐析 洗脱液 滤液20%的三氯乙酸沉淀、离心、透析 细胞色素C粗品溶液五、实验步骤1、 预处理：健康猪心去脂肪等结缔组织剪碎放入碎冰中（保护酶的活性，避免捣碎机破碎时使酶失活）放入生理盐水中清洗去污称重：烧杯80g，烧杯猪心=240g，（240-80）1.5=240ml酸化水组织捣碎机匀浆10min（匀浆3min，停5min，为了保证捣碎机安全）2、 提取：搅拌后静置2h四层纱布过滤后加入1.5倍酸化水于沉淀物中，在过滤后静置2h放入冰箱保存过夜从冰箱中取出加2mol/L氨水调PH至6.0，静置30min，过滤滤液加2mol/L氨水调P

4、H至7.5，静置30min,过滤3、 吸附：加10%人造沸石（滤液为220ml）磁力搅拌器搅拌吸附1h蒸馏水洗3次0.2%NaCI 溶液洗3次滤出人造沸石待用4、 洗脱：在柱中装人造沸石体积的三分之二蒸馏水将沸石放入柱中装满25%硫酸铵溶液进行洗脱，流速控制在2ml/min 以下, 收集红色的洗脱液（没分辨出红色液体阶段，收集了所有洗脱液）5、 盐析：在洗脱液（300ml）中慢慢加入固体硫酸铵75g, 边加边搅拌，使硫酸铵溶液的浓度为50%置4冰箱过夜过滤，收集滤液向过滤液中按22ml/L的量滴加浓度为20%的三氯乙酸溶液（过滤液和20%三氯乙酸溶液最好在4遇冷, 边加边搅拌, 加时要快, 防

5、止局部蛋白质变性）加完后分成8管，立即离心无明显沉淀，再5000转离心15min无明显沉淀，向每只离心管加入2滴浓度为20%的三氯乙酸溶液再5000转离心15min无明显沉淀，实验结束6、透析 将上述溶解后的细胞色素C 装入透析袋中, 放进500ml烧杯中（用磁力搅拌器搅拌），用去离子水透析, 除去硫酸根离子，15min换水一次，换手34次后，检查硫酸根离子是否已被除尽。检查方法：取2ml氯化钡溶液加入试管中，滴加23滴透析外液至试管中，若出现白色沉淀，表示硫酸根离子未除尽，如果不出现沉淀，表示透析完全。将透析液过滤， 收集滤液即为细胞色素C粗品。 记录此粗品的体积。7、检测 浓度检测： 细胞

6、色素C粗品是还原型和氧化型两种产品的混合物, 在测定含量时, 要加入联二亚硫酸钠, 使混合物中的氧化型转变为还原型，还原型细胞色素C水溶液在波长520nm 处有最大吸收值，根据这一特性，用分光光度计选一标准品，作细胞色素C 的浓度和对应的吸光值的标准曲线，然后根据所测溶液的吸光值，由标准曲线求出所测样品的含量。具体操作： 标准曲线的制定：取适量细胞色素C标准品，用蒸馏水稀释至10ml，从中取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0ml，分别放入5支试管中，每管补加蒸馏水至2ml，并加入少许联二亚硫酸钠作为还原剂，然后在520nm波长处测得各管的吸光值。以上述标准样品的毫升数为横坐标，吸光

7、值A为纵坐标绘制出标准曲线。样品中细胞色素C含量的测定：取样品1ml，再加少许联二亚硫酸钠，然后在波长520nm处测得A值（做两个平行样品，取平均值），根据此A值查标准曲线，换算得到细胞色素C的浓度。纯度检测： 因为细胞色素C属蛋白质，所以利用聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测所的样品分子量大小以及纯度，从而评价所的样品的质量。具体操作： 预先配置聚丙烯酰胺凝胶，样品和标准品分别混合缓冲液点样，再点上标准屏，在恒定电压作用下，达到分离的目的。后用考马斯亮蓝染液对蛋白质进行染色，后同脱色液脱去多余染液，得到电泳图。6、 实验结果与讨论1、检测结果：原液配置：精密称取细胞色素C 8.1微克，溶解于10毫升水，浓度0.81微克/毫升线性浓度0.10.20.40.60.81.0实际浓度0.04050.0810.1620.2430.3240.405吸光度0.04280.08160.15130.21970.29250.3599A组：吸光度：0.0136 浓度：0.0145微克/毫升B组：吸光度：0.0099 浓度：0.0131微克/毫升电泳检测结果：2、 讨论 从标准曲线图中