现代生物技术理论与实验：药物发现中的ADMET方法

1、III -药物发现中的ADMET方法,什么是ADMET,Absorption 吸收 Distribution 分布 Metabolism 代谢 Excretion 排出 Toxicity 毒性 ADME是药物动力学(Pharmacokinetics, PK)的内容,成功药物是个平衡体,药物活性,药物毒性,药物必备性质,药物必备性质 -药物开发的前提条件,物理化学性质 溶解性 化学稳定性 生物学性质 生物屏障渗透能力 药物代谢性质（生物稳定性） 药物排出性质 蛋白质和器官组织的结合力,药物研发的并行策略,合成化合物 或 分离天然产物,生物活性 生物选择性 物理化学性质 药物吸收 药物代谢 大分子

2、结合 细胞毒性 ,优化的 先导化合物,候选药物,现代ADMET研究方法的特点,基于细胞或生物大分子的分析方法 人源材料的应用 小样品、高内涵和高通量分析能力 能够阐明药物性质的分子机理、建立结构-药物性质定量构效关系,合理药物运输/制剂系统,以往的研究表明：药物运输系统只能辅助而不能根本性的改变药物的口服吸收能力 合理的药物运输/制剂系统(rational drug delivery)必须依据药物本身的穿越消化肠道屏障的渗透能力,BCS系统,FDA制定了BCS的评价指南。BCS的评价主要包括下列三个方面： 药物的生物渗透能力（permeability） 药物的溶解能力（Solubility）

3、制剂的快速溶出能力（Immediate Release） 上述性质符合要求的药物/制剂可以在药审时得到生物豁免。,药物吸收,吸收屏障结构,底侧（Basolateral）,顶侧（Apical）,经细胞连接 的被动扩散 Paracellular diffusion,穿细胞 被动扩散 Transcellular diffusion,代谢转化 A B,外流Efflux,药物转运 transport,A,C,D,药物消化道吸收的基本机制,体外单层肠上皮细胞药物吸收模型,肠上皮细胞/细胞系,组织/细胞培养,多空膜基底,吸收细胞单层,Transwell细胞培养板,已被认证的用于药物吸收的细胞系,Caco-2

4、 人结肠腺癌细胞 具有分化的肠上皮细胞特征和重要的药物转运与代谢酶 MDCK 狗肾上皮细胞系,Caco-2药物吸收模型的创建人Dr. R.T. Borchardt和他的部分研究团队,Caco-2模型的制备过程,细胞培养,Transwell接种,细胞汇合,细胞分化完备,细胞收集,2-3天,2-3天,23星期,药物吸收 测试,试验结果-渗透能力,吸收较好的药物： Papp 210-6 Testosterone：1.010-5 cm/s Propranolol: 2.8610-5cm/s 吸收差药物： Papp 10-6 Mannitol：1.010-7 cm/s Atenolol: Papp= 4

5、.5510-7 cm/s,Brain Blood Barrier（BBB）,BBB结构,内皮细胞和星形胶质细胞的相互作用,星形胶质细胞毛细血管内皮细胞 促进细胞紧密连接 诱导一些酶和分子转运蛋白 调节内皮细胞生长 毛细血管内皮细胞星形胶质细胞 趋化现象 表型的调节,BBB渗透机理,influx,efflux,紧密连接（tight junction）的结构,AP端：血液,BL端：脑实质,毛细血管内皮细胞,胶质细胞,神经胶质细胞,毛细血管内皮细胞,基底膜,多孔聚碳酯膜,药物排出,药物清除 = 代谢 + 排出,肾排出：超滤机制,游离小分子药物 及其代谢物,肾小球,肾小管,药物重吸收,大分子化合物 大

6、分子结合药物,肾排出因素：PPB 和 Papp,(Absorption fraction 0.9),(PPB0.05),胆汁分泌和肠肝循环,Drug,Binding to cytoplasmic proteins,肝脏处置药物的基本途径,胆汁,NTCP,OATPs,OAT2,OATP2,MRPs,MDR1,BCRP,BSEP/SPGP,肠道,药物,药物,代谢物,Basal （blood）,Apical （bile）,OATP2,MDCKII,(Sasaki, M., Sugiyama, Y. et al. J.Biol. Chem. 277(8), 6497-6593 (2002),药物经胆汁

7、排出的细胞模型- OATP2/MRP2 双转染 MDCK细胞单层,MRP2/cMOAT,药物的肝脏代谢,药物代谢的基本过程,药物 R,氧化产物 R-OH,结合产物 R-O-X,排出物,I相代谢,II相代谢,II+相代谢：药物外流,II相代谢,水解产物,X = glucose sulfate methionine cysteine glutathione,I相代谢关键酶-细胞色素P450,细胞色素P450 (CYP)家族 CYP1A2, CYP2A6, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1 and CYP3A4 NADPH依赖的氧化酶 CYP3A4 是药物的主要代谢酶

8、50%已知药物通过CYP3A4代谢,II 相代谢关键酶,UDP-依赖葡糖醛酸基转移酶(UGT) 苯酚磺基转移酶 (PST) 雌激素磺基转移酶 (EST) 谷胱甘肽-S-转移酶 (GST) 一些细胞抗氧化酶,三种肝细胞制品及代谢分析,全肝细胞代谢分析,肝微粒体代谢分析,S-9 肝匀浆液 代谢分析,药物肝脏代谢稳定性分析过程,药物肝脏代谢稳定性分析结果,% 原药消失率 =,（1 - ）100%,原始药物浓度c0,代谢反应后药物浓度ct,全肝细胞(),肝微粒体(),仅包括I相代谢酶 易于保存 分析操作容易、费用低,包括所有代谢酶和转运蛋白 费用高，细胞保存不易,S9肝匀浆液(),包括主要I、II相代

9、谢酶 分析操作容易、费用低 匀浆液保存不稳定,药物毒性,药物毒性评价的基本方式-细胞活力分析,细胞生长 细胞能荷 线粒体活性-MTT分析 细胞氧化还原状态-谷胱甘肽含量分析 细胞特征性功能 蛋白质合成 核酸合成 吞噬、排除外来分子能力等 细胞膜完整性-胞浆酶活性分析,MTT细胞活力分析,原理： 线粒体酶将探针分子MTT*还原成为一种蓝色脂溶性染料formazan（吸收波长550nm） 线粒体活性越高，转化能力越强 实验方法：将MTT加入到细胞培养液中，反应一段时间后，用有机溶剂溶解产生的formazan，然后用酶标仪测定 550 nm吸光度. 特点：方法简单可靠，费用低，高通量,* MTT：3

10、-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide,药物毒性分析过程,LD50，IC50，EC50,线粒体毒性模型,Early Prediction of Hepatotoxicity Through Technological Development World Pharmaceutical Congress, June, 2010,ROS,ATP synthesis,Cyt c,Djm,关于药物毒性分析数据,毒性分析的结果是LD50或IC50或EC50，表示药物导致细胞活力降低一半时需要的浓度 LD50或IC50或EC5

11、0越小，药物毒性越大 每种细胞活力分析方法都具有片面性，多种方法测定一种化合物毒性是有益的 进行药物毒性分析时，推荐使用人源的原代完整肝细胞，数据可靠性高 当使用永生化细胞和肿瘤细胞时，由于这些细胞(特别是肿瘤细胞)的药物代谢能力较差，因此得到的细胞毒性数据是一种“本征毒性(intrinsic toxicity)”。将实验数据推广应用时，注意补偿不同组织细胞的代谢能力。,药物毒性和药物-药物相互作用,排出抑制型相互作用： 药物1抑制药物2的排出，导致药物2浓度过高产生毒性 代谢抑制型相互作用 药物1抑制药物2的代谢，导致药物2浓度过高产生毒性 代谢诱导型相互作用 药物2诱导药物2的代谢，导致

12、药物2被过度活化，使代谢毒性产物浓度增加 药物2因代谢失效,小结：ADMET研究诸方面,ADME：生物利用率,药物间 相互作用,药物分布,血浆蛋白 结合力,血脑屏障 渗透能力,药物清除,药物吸收,消化道稳定性,肾排出,肝脏清除,代谢稳定性,胆汁排出,溶解性,渗透能力,代谢诱导,代谢抑制,药物毒性T,细胞活力 抑制分析,排出抑制,扩散能力,药物外流载体,药物吸收载体,代谢酶亚型,一个例子- 食物中的黄酮类化合物,食物成分黄酮类化合物及其作用,雌激素样作用 弱类雌激素活性 防治一些和激素水平下降有关的疾病，如衰老、更年期综合症、骨质疏松、血脂升高等 抗雌激素活性 预防激素依赖型肿瘤及心血管疾病的发

13、生。 抗氧化作用 抑制肿瘤作用 降低胆固醇、调节血脂，预防心血管疾病和老年性痴呆症,黄酮通式,异黄酮通式,黄酮苷和黄酮苷元,大豆异黄酮苷元,大豆异黄酮葡萄糖甙,水解,b-葡萄糖苷酶（肠道微生物）,肠道乳糖-根皮素水解酶,O,黄酮类化合物的吸收代谢机制,黄酮苷,黄酮苷元,水解,CYPs 代谢分解,MRP2,BCRP,UGT,SulT,紧密连接,MRP3,酶水解,酶水解,肝、肾排出,黄酮类化合物吸收的关键因素,黄酮苷的水解-利于吸收因素 肠道正常细菌群 黄酮苷元的代谢稳定性-不利于吸收因素 II相代谢和II+向外排出 I相氧化分解 解决方法： 混合黄酮制剂 苷元羟基甲基化,思考题,什么是ADMET研究，在药物发现中的作用是什么？ 现代ADMET方法有什么特点？ 什么是BCS？ 药物消化道吸收的分子机制有那些？ 什么是Caco-2模型？如何从Pa