免疫分析方法的研究进展

1、,免疫是机体识别和排除进人体,内的抗原性异物的保护性应答反应。,免疫分析法是生物酶技术、荧光光,谱技术、辐射技术、免疫分析技术,应用于分析领域的一门新技术，是,基于抗原和抗体之间的特异性识别,和结合反应为基础的一种微量分析,方法。,免疫分析法起始于本世纪,50,年,代,首先应用于体液大分子物质的分,析, 1960,美国学者,Yalow,和,Berso n,等将放射性同位素示技术和免疫反,应结合起来测定糖尿病人血浆胰岛,素浓度,开创了放射免疫分析方法的,先河。同年,Oliv er,将地高辛同牛血,清白蛋白结合,使之成为人工抗原,免疫动物后成功获得了抗地高辛抗,体,从而开辟了用免疫分析法测定小,分

2、子药物的新领域。,?,免疫分析法通过对半抗原或抗体,进行标记，利用标记物的生物或,物理或化学放大作用来进行工作，,它集测定的高灵敏性和抗体反应,的强特异性于一体。,?,优点：操作简单、快速、灵敏度,高、特异性强、价廉、样品所需,量少,非,标,记,免,疫,分,析,技,术,免疫扩散,标,记,免,疫,分,析,技,术,胶体金免疫技术,放射免疫分析,酶免疫分析,发光免疫技术,(CLIA),铁蛋白免疫技术,荧光免疫技术,(FIA),放射免疫分析（,RIA,）,酶免疫分析（,EIA,）,免疫电泳,免,疫,分,析,方,法,免疫分析标记技术,?,免疫分析标记技术是指以抗原抗体,间的特异性反应为基础,研究标记,以

3、各种标记物,(,定量信号,),来对某种,物质进行定性或定量检测的研究。,?,至,2007,年，,应用于免疫分析检测,中的各种标记技术,:,放射物标记、,酶标记、发光标记、荧光标记、金,标记和超顺磁粒子标记等,放射免疫分析,?,放射免疫分析是以放射性同位素为示踪物,与免疫反应相结合的一种分析方法,提供,的检测信号是不断发出的放射线。,?,常用来标记的放射性同位素有,3,H,、,14,C,、,25,N,、,121,I,、,125,I,等。,?,优点：准确灵敏、特异性强,仪器试剂价,格低廉、技术成熟。,?,缺点：药盒的使用寿命短,批间、批内变,异较大，难进行自动化分析。,酶免疫分析方法,?,酶免疫分

4、析是一种非放射性标记免疫,分析技术,以酶标记抗原或抗体作为示,踪物,由高活性的酶催化底物显色或发,光,达到定量分析的目的。,?,到目前为止,酶标记法所用的酶大多是,辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、酸性,磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。酶通过与,自己的特殊作用底物反应,而产生典型,的有色沉淀物。,优点：避免对人体的放射性伤害,环,境的污染,酶标记物较稳定,半衰期可,超过,1,年,.,酶免疫反应通常不需要温,育，不需将与抗体结合的标记药物,同游离的标记药物分开,.,产生的信号,用普通的可见一紫外分光光度计就,可测定,不需昂贵的仪器没备。,缺点：标记酶不像同位素标记物,荧,光标记物那样能直接产生信号,而必,须要

5、何其它试剂,如酶底物,辅酶的参,与,才能完成酶反应,引起吸收光谱等,变化后方可进行测定,.,荧光免疫分析法,?,荧光免疫分析法是以荧光物质标记,抗原或抗体,形成的标记物发生免,疫反应后,引起荧光强度发生变化,从而达到定量分析的目的。,?,目前为止认为比较满意标记物的有,:,异硫氰酸荧光素,( FITC ),、二氯三,嗪氨基荧光素,( DTAP),、四乙基罗,丹明,( RB200),和四甲基异硫氰酸罗,丹明,( TMR ITC ),。,化学发光免疫分析法,?,化学发光免疫分析是将高灵敏度的化,学发光测定技术与高特异性的免疫反,应相结合,借以检测抗原或抗体的分析,技术。它兼有发光分析的高灵敏度和,

6、免疫反应的特异性。,?,优点：灵明度高，线性范围宽，光信,号持续时间长，分析方法简便快速，,结果稳定、误差小，安全性好，使用,周期长。,灵敏度,10,酶标,放免,荧光,发光,(mol/L),10,-,18,10,-,15,-,12,10,-,9,酶标,荧光,放免,发光,线性范围,10,5,10,4,10,3,10,2,方法,优,点,缺,点,放射免疫,试剂成本低，灵敏度较,高,操作复杂，放射性污染，,有效期短,酶联免疫,试剂成本低，操作简单,灵敏度低，适用于定性和,半定量测定,化学发光,操作简单，成本较低，,灵敏度较高，试剂较,稳定,工作曲线随时间漂移,时间分辨,灵敏度较高，试剂较稳,定,操作复

7、杂，发光时间短，,试剂成本高，仪器维护,费用较高,电化学发,光,灵敏度较高，试剂较稳,定,操作复杂，试剂成本高，,仪器维护费用较高，有,本底干扰,化学发光免疫分析含有免疫分析和化学发,光分析,2,个系统。免疫分析系统是将化学发,光物质或酶作为标记物,直接标记在抗原或,抗体上,经过抗原与抗体反应形成抗原,-,抗体,免疫复合物。化学发光分析系统是在免疫,反应结束后,加入氧化剂或酶的发光底物,化,学发光物质在碱性介质中经氧化剂的氧化,时释放大量自由能,产生激发态的中间体，,该激发态的中间体由最低振动能级回到稳,定的基态，,各个振动能级时产生辐射，同,时产生能量，多余的能量即为发射光子，,从而产生发光

8、现象。发光强度可以利用发,光信号测量仪器进行检测、分析接收光量,子的产量，根据化学发光标记物与发光强,度的关系,可利用标准曲线计算出被测物的,含量。,常见的发光体系,?,鲁米诺、异鲁米诺及其衍生物类：,?,吖啶类化合物：,（金刚烷）,-1,2-,二氧乙烷及其衍生物,电化学发光体,生物发光体系,?,北美荧火虫体内的荧光素,/,荧光素酶是,著名的生物化学发光体系,它由虫荧光,素酶、虫荧光素,D-(-)-2-,6,-,羧基,-,2,苯,并噻唑,-,2-,噻唑啉,-4-,羧酸,、,ATP,、,Mg2+,及,O2,所组成。虫荧光素酶在催,化时,首先与虫荧光素酰腺苷酸,(,由,Mg2+-ATP,与虫荧光素

9、复合而成,),生成,复合物,然后该复合物放出质子,酶变,构导致虫荧光素氧化脱羧并发射光子。,另一生物发光体系是水母发光蛋白,它,不需要加入荧光素酶,只需加入,Ca2+,或,Se2+,便能通过分子内反应而发出,max,为,470 nm,的蓝光。生物发光体系,的特点是发光效率、灵敏度、选择性,均非常高。,其他无机氧化剂的化学发光体系,?,近年来，一些科学家就一些无机氧化,剂直接氧化一些物质产生化学发光的,化学发光新体系,如高锰酸钾、铈,(,),、,过氧化氢、高碘酸钾、次氯酸盐和铁,氰化钾等在药物分析方面的应用展开,了研究，并取得了一定的成果。,总结与展望,?,总之,免疫学分析技术的发展也就是,标记学的发展。目前,多种免疫分析,标记方法并存,相互竞争,相互补充,如将,EIA,与荧光技术或化学发光技术,结合,