免疫药实验方法药理实验方法学

1、1,第一节,概述,一、免疫学研究概况,免疫学的,3,个时期：,经验免疫期,科学免疫期,现代免疫期,2,经验免疫学时期,中国明代，正式记载接种“人痘”，预防天,花,18,世纪中叶，英国医生,Edward Jenner,种牛,痘预防天花,目前，通过全球性大面积疫苗接种我们已经,消灭了天花病毒,3,4,科学免疫学时期,病原菌的发现与疫苗使用的推广,19,世纪中叶，显微镜的改进使人们可在镜下直接观察到,细菌，导致病原菌的发现。,1850,年，首先在感染羊的血液中看到了炭疽杆菌。,Pasteur,证明实验室培养的炭疽杆菌能使动物感染致病，,并且发明了液体培养基，以培养细菌。,Koch,发明固体培养基，分

2、离培养结核杆菌成功，提出,病原菌致病的概念。,Emil von Behring 1854 - 1917, Nobel,Prize in 1901 for demonstrating that,circulating antitoxins against diphtheria,（白喉）,and tetanus,（,破伤风）,toxins,conferred immunity.,Louis Pasteur 1822-1895,Father of,immunology, attenuated bacteria and,viruses as vaccine against anthrax,（炭,疽）,

3、.,Edward Jenner 1749-1822,Successful vaccination against smallpox,（天花）,Robert Koch 1843-1910,Nobel Prize,in 1905 for his work on tuberculosis,（肺结核）, Anthrax,（炭疽）,Cholera,（霍乱）, Tubercule,bacillus,（结核杆菌）,7,科学免疫学时期的重要成就,?,减毒疫苗的发明,?,抗毒素的发现,?,补体的发现,?,血清学方法的建立,?,免疫化学的研究,现代免疫学时期,?,免疫应答细胞和,T,细胞亚类的发现,?,免疫网络学

4、说的提出,?,抗体生成克隆选择学说,的提出,?,细胞因子研究进展,?,免疫学技术的发展（免疫标记技术）,?,免疫耐受现象的发现,Clonal Selection Theory,（,Burnet,学说,1960,年诺贝尔奖,）,?,体内存有能识别各种抗原的细胞克隆,(clone),，每一细胞表,面均有对特定抗原的受体，能与相应抗原结合而识别它们。,?,抗原的作用在于选择与其相应的细胞克隆与其受体结合后，,引起细胞的增殖分化，产生免疫应答。,?,胎生期免疫细胞与自己抗原相接触形成天然自身耐受状态,（禁忌细胞系）,?,免疫细胞系可突变产生与自己抗原发生反应的细胞系可形,成自身免疫反应,此学说对,免疫

5、学中的根本问题,自我识别,有了比较满意,的解释，对免疫学中的其他重要问题，诸如免疫记忆、免疫,耐受性、自身免疫性等现象也能作出恰当的说明，因此被人,们广为接受，成为,现代免疫学的理论基础,。,10,11,研究进展,1.,抗原识别受体多样性的产生,2.,信号转导途径的发现,3.,细胞程序性死亡途径的发现,4.,造血与免疫细胞的发育,5.,应用免疫学的发展,(1)DNA,疫苗,(2),基因工程制备重组细胞因子,(3),免疫细胞治疗,(4),完全人源抗体,(5),口服自身抗原,预防自身免疫病,12,二、免疫功能的病理生理及免疫功能的调节,免疫应答：,是机体借助理化屏障及神经体液调节控制，,通过免疫细

6、胞及有关的体液因子（,抗体,or,淋巴因子等,）发挥,识别自己、排除异己，以维持机体内外环境统一的一种功能。,非特异性免疫应答：,是机体防御异物进入机体以及对,进入体内异物的清除作用，是机体与生俱来的免疫功能。,特异性免疫应答：,是机体发育过程中接触抗原后发展,而成的免疫力，包括体液免疫和细胞免疫。,13,免疫应答的,3,个阶段：,（,1,）,感应期,抗原进入机体后，多数由单核巨,噬细胞摄取与加工，再将抗原信息传递给,T,、,B,淋巴,细胞，使之能特异性地识别抗原。,（,2,）,增殖分化期,抗原激活,淋巴细胞,T,、,B,淋巴细胞,致敏淋巴细胞、浆细胞。,（,3,）,效应期,再次遇到抗原,致敏

7、淋巴细胞、,抗体,细胞免疫、体液免疫。,14,15,17,18,免疫病理与免疫性疾病,按发病机制不同,免疫性疾病分为：,超敏反应性疾病,免疫缺陷病,：先天性及继发型免疫缺陷病,自身免疫病,：类风湿性关节，系统性红斑狼疮,干燥,综合征,多发性硬化,移植排斥和移植物抗宿主反应,速发型：由抗体介导，,发作快,如：哮喘、荨麻疹等,迟发型：由细胞免疫介导，发作慢,见于结核病、接触性皮炎,19,目前临床所用的影响免疫功能的药物有：,免疫增强药：,胸腺素、卡介苗、干扰素（免疫,调节）、左旋咪唑等。,免疫抑制药：,环孢素,A,、他克莫司、糖皮质激,素、环磷酰胺、抗淋巴细胞球蛋白。,中药类：,双向免疫调节，如：

8、人参、黄芪、灵芝、猪苓、,枸杞、银耳、鹿茸、云芝等植物多糖。,免疫抑制，如：川乌总碱、氧化苦参碱、雷公,藤多苷、生物碱等。,20,80.28%,19.72%,免疫抑制剂,其他免疫系统药物,中国医院用药评价与分析,2009;9(10):726-729,21,三、研究的基本要求,（一）动物的选择,由于免疫反应和基因类型有关，尽可能,用,纯系,动物。如纯系小鼠和大鼠，并控制鼠,龄、性别和体重，以减少个体差异。若用杂,种动物，最好用,同窝,动物。,22,（二）,动物模型,1,、模型特点和要求,（,1,）,正常,实验动物,（,2,）免疫功能,低下,的动物模型,（,肿瘤、衰老、,慢性病均可造成免疫功能低下

9、,）,免疫抑制剂造模（,如环磷酰胺、氢化可,的松、环孢霉素,A,）,辐射引起免疫功能低下动物模型,23,常用的免疫抑制剂,1.,环磷酰胺,：,80,100mg/kg,，,Sc,，,5,天后免疫,功能显著降低。,2.,氢化可的松,：,50,100mg/kg,，,Sc,，,6,8,天后,免疫功能显著降低。,3.,抗淋巴细胞血清,（,ALS,）,:ip 0.2ml,，,5,6,天后,免疫功能显著降低。,4.,60,Co,或,X,射线,600,800,拉德照射,1,次，,4,日后免,疫功能显著降低，动物存活时间显著缩短。,24,（,3,）,免疫缺陷,动物,Nude,小鼠,：,该小鼠先天性无胸腺，细胞免

10、疫,力低下，失去正常,T,细胞功能。但其,B,淋巴细胞功,能基本正常。,BALB/c,nu,、,NC-nu,、,C3H-nu,、,Swiss-nu,Scid,小鼠,：,即重度联合免疫缺陷小鼠。,Scid,小鼠外观与普通小鼠差别不大，有毛，被毛白色，,体重发育正常。但胸腺、脾、淋巴结的重量不及,正常的,30%,，组织学上表现为淋巴细胞显著缺陷。,BALB/c-Scid,25,（,4,）,自身免疫性疾病,模型：,类风湿性关节炎,、系统性红斑狼疮、,干燥综合征、多发性硬化症,（,5,）,过敏性疾病,模型：,哮喘，过敏性鼻炎，接触性皮炎等,26,?,佐剂性关节炎模型,?,是免疫性关节炎动物模型的基本方

11、法。,?,造模多采用大鼠,足跖部皮下注射法,原发病变,主要表现为致炎局部的炎症反应,续发病变一般,于致炎后,10-20,天左右出现, 20,天左右达到高峰,病理改变为滑膜下组织炎症,滑膜增生,血管翳,形成,软骨破坏, 4,周后,关节红肿减退,骨质减,少,新骨形成,关节间隙变窄,形成不可逆的关,节改变。,?,AA,大鼠的关节组织病理学及血中变化与人相似,同时,对其免疫学机制研究发现,此模型存在明,显的细胞免疫异常。,27,?,II,型胶原诱导的关节炎模型,?,II,型胶原,+,完全弗氏佐剂,乳化制成乳剂,将该,乳剂于小鼠的尾根部皮内注射致炎,腹腔注射乳,剂作为激发注射。,?,表现为多发性外周关节

12、炎,关节局部红肿,严重,致关节畸形,病理变化为增生性滑膜炎,关节软,骨破坏,骨侵蚀,关节腔内有炎性细胞浸润,体,内可检出针对自身型胶原的高滴度的,IgG,抗体,这,些临床表现及实验室指标与人密切相关。,?,不出现病情的波动和复发情况,也没有的皮下结,节,浆膜炎,血管炎等表现,不出现类风湿因子及,抗核抗体,28,?,卵蛋白诱导的关节炎模型,?,卵蛋白,+,福氏佐剂混匀,注入动物背部皮下,致敏,末次,注射后一周于关节内注入溶解的卵蛋白, 24,小时内此关节,出现红肿热痛等急性炎症的表现,发病率达,100%,。,?,卵蛋白诱导的关节炎模型的病理改变有滑膜增生、血管翳,形成和软骨及骨破坏。,?,第一阶

13、段为关节内注入抗原后, 24,小时出现关节肿胀,关,节直径增加,病理表现为急性滑膜炎。,?,第二阶段为,1-4,周,关节滑膜明显增生,血管翳形成。滑,膜细胞以单核细胞、巨噬细胞为主,其次为淋巴细胞,以,CD4+,淋巴细胞多见,这一阶段部分动物可出现早期软骨破,坏。,?,第三阶段在,4,周后,不可逆的关节软骨及骨破坏出现,最后,可出现骨变形。最长的观察到,6,个月,慢性炎症仍存在,证明卵蛋白诱导的关节炎模型与在发病机理上的某些类似,。,29,2,、观察指标,（,1,）,非特异性免疫,功能的测定指标,（,2,）,体液免疫,功能的测定指标,（,3,）,细胞免疫,功能的测定指标,3,、给药途径和剂量,

14、4,、对照实验,30,第二节,实验方法,一、影响非特异性免疫功能实验,（一）碳粒廓清法,【基本原理】,网状内皮系统（,RES,）是机体最主要的防御系统，,具有强大而迅速的吞噬廓清异体颗粒或某些可溶性异,物的能力，并能迅速清除体内自身产生的某些有害物,质。,当静脉注入,特定大小,的,惰性,颗粒后，它即可被,RES,细胞迅速吞噬而从血流中廓清，因此，可借助测,定,血流中炭粒的消失速度,来反映,RES,吞噬异物的能力。,31,【实验步骤】,（,1,）取小鼠，随机分组，给药。,（,2,）末次给药后,30min,，每鼠,iv,印度墨汁,0.05,0.1ml/10g,体重。,（,3,）于,1min,（,t

15、,1,）和,5min,（,t,5,）后，每鼠眼,眶静脉取血,20,m,l,，加到,2ml 0.1%NaCO,3,溶液,中摇匀。,（,4,）测,OD,680nm,，计算廓清指数（,K,）、吞,噬指数。,32,廓清指数,K,吞噬指数,即校正廓清指数,1,5,5,1,log,log,t,t,OD,OD,?,?,4,/,log,5,1,OD,OD,脾重,肝重,体重,?,3,K,33,【注意事项】,（,1,）印度墨汁应用,NS,稀释,1,5,倍左右，最好经,超,声,处理后,离心,，弃去沉淀物，以免凝集的炭粒阻塞肺,毛细血管，引起动物猝死。,印度墨汁的质量可影响测定结果的准确性，墨汁,颗粒大小有严格要求，

16、,过大则不被吞噬，过小则被其,他吞噬细胞吞噬，,如小吞噬细胞。印度墨汁因颗粒大,小均匀，能特异性地被单核巨噬细胞所吞噬，因而适,用于本实验。,（,2,）,iv,要熟练，,印度墨汁的剂量、取血时间,必须准,确无误。另外，取血的时间间隔也可延长至,10,分钟。,34,【评价】,印度墨汁法测定,RES,吞噬活性是,最经典,的一种,免疫学研究方法，实验条件要求不高，方法简便，,结果可靠，重现性好。,若再配合小鼠腹腔,巨噬细胞吞噬消化鸡红血球,实验及,白细胞游走,实验，则可较全面地反映单核巨,噬细胞系统清除异物功能状态。,35,（二）小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞法,【基本原理】,M,具有强大的吞噬能力，

17、鸡红细胞对鼠类是一,种较强的抗原性异物，当其被注入小鼠腹腔后，可,引起腹腔,M,聚集并吞噬，注入定量鸡红细胞,（,CRBC,），隔一定时间后，吸取腹腔,M,，,镜检其,吞噬活性,，并以吞噬百分率及吞噬指数的高低表示,M,吞噬能力的大小。,36,【实验步骤】,（,1,）取,18,22g,小鼠，雌雄各半，随机分组。,（,2,）若筛选免疫抑制药，预先用,M,诱导剂,，可在,实验前,3,4,天，,ip0.5,淀粉,生理盐水溶液，每鼠,0.5ml,。,（,3,）,4,天后，,ip,，,5,CRBC 0.5ml,。,8,12h,后脱,颈椎处死小鼠，,ip2ml NS,，轻揉腹部,1min,，然后吸,出洗液

18、,1ml,，分滴于两片载玻片上，放入垫有湿纱布,的搪瓷盒内，移置,37,孵箱温育,30min,。,（,4,）用,NS,漂洗，除去未粘片的细胞。晾干，,1,1,丙酮甲醇溶液固定,5min,。,4,（,V/V,）,Giemsa,磷,酸缓冲液染色,3min,，用流水冲洗、晾干，镜检。,37,【结果判定】,油镜下计每片,200,个,M,，计算吞噬百分率、,吞噬指数。,吞噬百分率,100,吞噬指数,2,噬的）,个巨噬细胞（吞及未吞,的巨噬细胞数,吞噬,200,CRBC,个巨噬细胞,被吞噬的,200,CRBC,38,CRBC,被消化的程度，通常分,4,级：,级：,未消化。,CRBC,完整，胞质浅红或浅黄带

19、,绿色，胞核呈浅紫红色。,级：,轻度消化。,胞质浅黄绿色，胞核固缩呈紫,蓝色。,级：,重度消化。,胞质淡染，胞核呈浅灰黄色。,级：,完全消化。,M,内仅见形态类似,CRBC,大小,的空泡，边缘整齐，胞核隐约可见。,39,【注意事项】,（,1,）实验各步骤均需保持,无菌操作,。,M,诱导剂,仅用于免疫抑制药研究。,（,2,）若滴片,染色,过深，可用,1%HCl,脱色，过浅,则可复染。,（,3,）每鼠,两片的计数,应基本一致，若差距过大，,应予淘汰。腹腔吸出的液体若有血性渗出时，则,不宜使用。,40,（,4,）掌握好,实验时间,，时间太短，吞噬鸡红细胞,较少，过长则鸡红细胞已被消化。,（,5,）,

20、避免腹腔注射受试药物,，以免干扰实验结果。,【评价】,本法简便，但操作慢而欠精确，可配合其,他方法进行综合分析。,41,（三）巨噬细胞吞噬作用的化学发光测定法,【基本原理】,化学反应中电子,激发态,产物，在其回到,基态,过,程中，以光的形式释放能量,or,将能量转移到另一分,子而发射光子，利用,发光检测仪,测定发射光的强度,or,速度，即可计算发光物质,or,发光物质标记的抗原,or,抗体的含量。测定发光强度的方法，即光子计数,法，可用,液体闪烁仪,进行测定。,42,M,吞噬颗粒,or,受其他生物与化学因子刺,激后，细胞代谢猛增，其特征是,耗氧量增加,，,产生,大量自由基,（氧负离子、过氧化氢

21、、羟,自由基、单线态氧），同时，往往伴有,化学,发光,现象，但十分微弱，难以检测。若在体,系中加入,鲁米诺,等,发光增强剂,，就能增强发,光强度，因为氧化剂激发鲁米诺，可发出,425nm,的光，易被检测到。,43,【操作步骤】,（,1,）用,HBSS,将,M,调整至,2,10,6,个,/ml,的细胞悬液,备用。,（,2,）取细胞悬液,1ml,，置聚乙烯小管中，加入,10,-4,M,鲁米诺,200,m,l,，将小管放入液闪测量瓶中，测定发光,6,秒钟，作为本底。,（,3,）加入,调理,的,酵母多糖,200m,l,，摇匀，即刻测发,光,6,秒钟，以后每隔,3,5min,测一次发光，直至加酵,母多糖

22、,1h,。,（,4,）以发光强度（,cpm,）为纵坐标，加酵母多糖后,的时间为横坐标，绘制,M,吞噬发光的动力曲线。比,较各组的峰高、峰时（峰高的时间）、发光积分值及,早期曲线斜率的变化。,44,【注意事项】,（,1,）注意无菌操作。所用试管、滴管、缓冲液等,均需高压灭菌，应在超净台内操作，避免污染。,（,2,）用台盼蓝染色，,M,活力应在,90,以上。,（,3,）所用药物应能完全溶解，悬浮的微粒将会影,响,M,的反应性。,（,4,）小试管与测量瓶先置暗室,24h,，整个操作系,统均在暗室进行。,45,【方法评价】,（,1,）本法也可检测,M,氧代谢功能与血清调,理作用，故作为检测吞噬功能的指

23、标的专一,性不够。,（,2,）因液闪仪无温控装置，不能使反应系,统达到,37,，只能通过恒定的室温（,25,1,）,与水浴,37,进行间接控制。,46,（四）溶菌酶测定法,【基本原理】,溶菌酶是一种小分子蛋白质，存在于机体的泪液、,痰、鼻涕、,WBC,、血清等。测定它在体液,or,分泌,物中的含量及其变动情况，可作为侧面了解机体防,御功能的一个指标。,体液和分泌物中的溶菌酶活性，可通过检查其,对指定,敏感菌株,的裂解作用来进行测定。,47,2,种测定法：,（,1,）光学测定法：,将检品与菌液混合，用分,光光度计观察指定时间内透光度改变的百,分数。,（,2,）平板打孔测定法：,在混有菌液的琼脂凝

24、,胶上打孔，检品放在孔内，一定时间后测,定溶菌环直径。,48,二、影响特异性体液免疫功能的实验方法,（一）血清溶血素测定法,【基本原理】,经,SRBC,免疫动物的淋巴细胞可产生抗,SRBC,抗,体（,溶血素,），并释放至外周血。这种抗体在试管,内与,SRBC,温育，在补体（,正常血清中的一组酶蛋,白，具有溶解和杀伤细胞，增强吞噬等作用,）参与,下可产生溶血反应，通过测定,血红蛋白的释放量,多,少来间接测出血清中溶血素的含量。,血红蛋白与,都氏试剂,反应形成,氰化血红蛋白,后,比色测定。,49,【操作步骤】,（,1,）,免疫：,小鼠，,ip 20,SRBC 0.2ml/,天，,第,4,天取血、分

25、离血清，将血清稀释后供测定,（一般,500,倍以上）。,（,2,）,溶血反应：,在试管内依次加入血清,1ml,、,5,SRBC 0.5ml,、,10,补体,1ml,，置,37,水浴,30min,，然后移至冰浴中终止反应，,1500rpm,离心,5min,，取上清,1ml,，加都氏液,3ml,，摇匀,放置,10min,，测,OD,540nm,。,50,（,3,）,SRBC,半数溶血值,：取,5,SRBC 0.25ml,加都氏液,4ml,，测,OD,540nm,。,（,4,）,计算：,样品管半数溶血值,HC,50,：,每只鼠的血清,HC,50,稀释倍数,半数溶血时的吸光度值,样品的吸光度值,SRB

26、C,51,【评价】,（,1,）简单易行，快速，重复性好。测定,HC,50,较准确，客观，可克服溶血空斑法用,肉眼计数的错误。,（,2,）本实验用,615,纯种小鼠测出的数据比,较稳定，重现性好。,52,（二）抗体形成细胞测定法（,PFC,）,1,溶血空斑试验（,haemolytic plaque assay,，,HPA,）,【基本原理】,PFC,是一种体外检测单个抗体形成细胞（浆细胞）,的方法。将,SRBC,免疫的小鼠脾细胞、,SRBC,、补体,混合于琼脂内，抗体形成细胞分泌的抗体在补体的,参与下，使其周围的,SRBC,的溶解形成肉眼可见的溶,血空斑，这种溶血空斑大体上可以反映抗体形成细,胞数

27、。,方法：琼脂固相法（平皿法）：常用。,液相单层细胞法（玻片法）：很少使用。,54,?,直接溶血空斑试验,:,测定,产生,IgM,型抗体的,细胞,。,因为活化补体的能力强，只加细胞,和补体即可出现空斑，故称直接溶血空斑,测定。,?,间接溶血空斑试验,:,产生其他类型抗体的,（如,IgG,或,IgA,等）细胞,检测，,需要加靶,细胞和抗各类,Ig,的抗血清,再加补体才能出,现可见的空斑，故称间接溶血空斑测定。,55,【操作步骤】,（,1,）琼脂固相法,直接法,1,）,免疫动物：,选用纯系小鼠，随机分组，每鼠,腹腔注射,5,的,SRBC 0.2ml,致敏。,2,）,制备补体，,同前。,3,）,制备

28、底层琼脂：,称取,1.4g,琼脂糖加入,100mlGeys,液中，煮沸，溶化后分装若干只预温,的试管，每管,5ml,，置,45,恒温水浴保温。然后倾,入水平放置的平皿（直径,9cm,）中，凝固后打开平,皿盖，将平皿反扣放入,37,温箱,1h,，备用。,56,4,）,制备脾细胞悬液：,免疫后第,4,天，用冷,Geys,制备,10,7,/ml,脾细胞悬液，置,4,冰箱备用。,5,）,上层琼脂的制备：,称取,0.7,琼脂糖加入,100mlGeys,液中煮沸，溶化后分装若干只预温的,试管，每管,1.5ml,，置,45,恒温水浴保温。逐个取,出，依次加入,SRBC,悬液（,2,10,9,/ml,）,0.

29、1ml,、,10,7,/ml,脾细胞悬液,0.1ml,，充分混匀，立即倾入上,述制备好的底层琼脂平皿中，均匀铺平，凝固后,静止,10min,。,57,6,）将平皿置,37,、,5,CO,2,培养箱,培养,2h,，,每皿中加入,1,10,稀释的,豚鼠血清,1.0ml,，,均匀覆盖于表面，继续温育,40,50min,，,取出后置室温,1h,，,4,冰箱过夜，次日倾去,补体，,or,加入,0.25%,的戊二醛（,NS,配置），,使,细胞固定后计数空斑,。,58,7,）,空斑计数与评定：,用放大镜,or,双目解剖,镜可见每个空斑由抗体分泌细胞及其周围的,透明区域组成。计数每个平皿（,10,6,个细胞）

30、,的空斑数。,（,2,）琼脂固相法,间接法：在上述,5,）中,再加入适当浓度的抗,-Ig,血清,0.1ml,，其他步,骤相同。,59,【注意事项】,（,1,）,SRBC,既是免疫细胞，又是靶细胞和指,示细胞，故,SRBC,要新鲜，洗涤不得超过,3,次，,每次离心,5min,。用,Alsevers,液保存的,SRBC,可使用,2,周。,（,2,）为了,消除非特异性溶血,，豚鼠血清在,使用前必须经,SRBC,吸收，补体的浓度以,1,10,稀释为宜。,60,（,3,）制备脾细胞悬液：若将取出的脾立即,放入,0,冰浴，可明显降低空斑计数；在,20,以下操作，不超过,15min,，对空斑,计数并无影响。

31、,（,4,）测定抗血清的显斑常数（,K,D,）和抑,斑常数（,K,I,），作为空斑计数的校正。,61,（,5,）倾注底层琼脂糖时，一定要将平皿放,置,水平位置,，以便使底层琼脂糖水平光滑。,倾上层琼脂糖时，各种细胞成分要充分混匀。,不能剧烈震荡,，,以免出现气泡。水浴温度应,控制在,47,49,之间，温度过高使细胞变性；,过低使琼脂糖凝固，影响细胞分散。,62,2,分光光度法,【基本原理】,又称,SRBC,的定量溶血测定法，基本原理,同溶血空斑法。但本法可,定量测定,抗体形成,细胞所分泌的,抗体,，,较溶血空斑法精确,。同,时操作比较简便。,63,【操作步骤】,（,1,）免疫动物：同前。,（,

32、2,）制备脾细胞悬液：基本同前，制成,5,10,6,/ml,脾细胞悬液，或按,15mg,脾重,/ml,制成脾细胞悬液。,（,3,）,溶血反应,：取试管若干只，每管依次加入,脾,细胞悬液,、,0.2,SRBC,、,1,10,豚鼠血清,各,0.5ml,，,充分混匀，另设不加补体的空白组。置,37,水浴中,温育,1h,，离心,3000rpm,，,5min,。,（,4,）,测,OD,值,：取上清测,OD,413nm,。,64,【注意事项】,（,1,）若使用杂种鼠时，宜将每两只小鼠的,脾混合液制备脾细胞悬液，可减少实验误差。,（,2,）反应系统中其他条件不变时，,SRBC,浓,度可根据受试药的免疫增强,

33、or,抑制作用作适当,调整。如检测免疫增强药时，应将,SRBC,的半,数溶血值调在,0.35,左右，以便使测定值在分光,光度计敏感范围内。,65,三、影响特异性细胞免疫功能的实验方法,（一）淋巴细胞转化试验（,3,H-TdR,掺入法）,【基本原理】,淋巴细胞在有丝分裂原的刺激下，转化为,母细胞，并分化增殖，细胞内蛋白质和核酸,合成增加，并释放多种淋巴因子。如在培养,液中加入,3,H-TdR,，使其掺入到新合成的,DNA,中，可以定量细胞内的,DNA,合成强度。,66,有丝分裂原：,PHA,（植物血凝素）,刺激,T,细胞,Con-A,（刀豆球蛋白）,刺激,T,细胞,LPS,（脂多糖）,刺激,B,

34、细胞,67,【操作步骤】,（,1,）纯系小鼠，,2,3,月龄，雌雄均可。处,死小鼠，在无菌条件下迅速取出脾脏，放入,盛有,RPMI1640,培养液的平皿中（冰浴），剪,碎，用注射器针芯捣烂，过,100,目钢筛，,制成,脾细胞悬液,。,（,2,）用培养液离心洗涤脾细胞,3,次，用,台盼,蓝,检查活细胞数在,95,以上。将细胞用培养,液稀释成,2,10,6,个,/ml,。,68,（,3,）将脾细胞加入,96,孔培养板，每孔,200l,，,3,4,复孔（,也可更多,）。,加入有丝分裂原，,培养,72h,。,（,4,）终止前,6h,，每孔,加入,3,H-TdR,1m,l,，使其,终浓度为,1,5ci/

35、ml,。,（,5,）用,微量多头,细胞收集,仪,，将细胞抽吸在,49,型玻璃纤维滤纸上，置,80,烘箱内干燥,30min,。,（,6,）将烘干的滤纸片放入盛有闪烁液的小,瓶中，用,液闪仪,测定样品中的放射强度,（,cpm,）。,70,【注意事项】,（,1,）无菌操作。,（,2,）脾细胞制备要放在冰浴中，避免细胞死,亡带来误差。,（,3,）中药粗制剂中影响因素较多，注意假阳,性。,【评价】,（,1,）,3,H-TdR,掺入法客观准确。,经典方法。,（,2,）可直接观察药物本身对淋巴细胞转化的,影响，也可观察与有丝分裂原的协同,or,拮抗,作用。,71,MTT,法：,【基本原理】,Mosmann,

36、等根据细胞内能量代谢水平与,DNA,合成水平平行相关，首创了,四甲基偶氮唑盐,（,MTT,）,比色法。,MTT,进入细胞后作为反应底物，,被氧化成蓝色的,甲臜,（,formazan,），存积于细胞,内及周围，加入,DMSO,，使细胞破裂，并使细胞,内甲臜释放出来，测定,OD,490nm,。,72,（二）二硝基氟苯诱导小鼠,DTH,反应,【基本原理】,DNFB,是一种,半抗原,，将其溶液涂抹腹,部皮肤后，与皮肤蛋白结合成,完全抗原,，,由此刺激,T,淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞。,47,天后将其再次涂抹皮肤，可使局部产生,DTH,反应，一般在抗原攻击,2448h,达高峰,，,故此时测定局部肿胀。,

37、73,【操作步骤】,（,1,）,致敏：,小鼠，随机分组，腹部去毛，,范围约,3,3cm,2,，并将,1,DNFB,溶液均匀,涂抹于腹部皮肤，必要时于次日再强化一次。,（,2,）,DTH,反应产生与测定：,致敏后第,5,天，,将,1,DNFB,溶液,10l,均匀涂抹于小鼠右耳,（两面）进行,攻击,，对照组同样涂耳但未致,敏。,74,攻击,24h,后，脱颈处死小鼠，用直径,8mm,的打孔,器打下圆形,耳片,，称重，以左右耳片总量之差为,肿,胀度,；同时取小鼠,胸腺及脾脏,称重，计算脾指数和,胸腺指数（以每,10g,体重计）。,【注意事项】,（,1,）,DNFB,溶液要临用前,新鲜配制,。,（,2,

38、）在小鼠腹部应尽量去毛，且应避免剪破皮肤。,（,3,）操作者避免,DNFB,与皮肤接触。实验环境控,制在,20,2,为宜。,小,结,一、影响非特异性免疫功能实验,（一）碳粒廓清法,/,吞噬鸡红细胞法,/,化学发光测定法,(,巨噬,细胞,),（二）溶菌酶测定法,（三）硝类兰四氮唑（,NBT,）还原试验,(,中性粒细胞,),（四）,NK,细胞活性检测,LDH,法,二、影响体液免疫功能的实验方法,（一）血清溶血素测定法,（二）抗体形成细胞测定法（,PFC,）,（三）抗体水平的检测,三、影响细胞免疫功能的实验方法,（一）淋巴细胞转化试验,（二）,DTH,反应,（三）细胞因子测定,（四）细胞亚群检测,76,常用免疫学技术,1.,免疫沉淀,利