生物制药工程：第二章 第五节--DNA重组的操作

1、第五节DNA重组的操作,一、粘性末端的连接 （一）同一种酶产生的黏性末端的连接,DNA连接酶把相互靠近的5端磷酸与3-OH连到一起 单酶切、双酶切,第一部分 DNA的体外重组,DNA的体外重组：将目的基因与载体连接，这种重新组合的DNA称为重组DNA。,两段DNA的连接,DNA片断与载体的连接,不足： 目的基因的正反向插入 载体或目的基因片段会自身环化 载体与多个目的基因片段之间重组,（二）不同种酶产生的黏性末端的连接,（一） 直接连接,T4 DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的110%。,5,5,5,5,3,3,3,3,-OH,-OH,-P,-P,P-,P-,HO-,HO

2、-,5,3,-OH,-P,P-,HO-,5,3,二、平末端（blunt end）的连接,将黏性末端变成平末端的方法：,（1）5突出黏性末端的补平 采用大肠杆菌聚合酶的Klenow大片段 （2）3突出黏性末端的切平 T4噬菌体DNA聚合酶或S1核酸酶,在连接反应体系中加入： 高浓度的DNA连接酶 较高浓度的外源DNA和载体DNA 低浓度的ATP 低浓度的聚乙二醇,平末端连接存在一些缺陷： （1）连接效率低； （2）破坏限制性内切酶原有的识别位点； （3） 插入没有方向性； （4） 高底物浓度下会产生多拷贝外源片段插 入载体。,（1）同聚物加尾法,（二） 人工加尾形成 “粘性末端”,DNA末端转移

3、酶能在没有模板的情况下给DNA的3-OH端加上脱氧核苷酸。, 原理：,分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。, 加尾碱基互补,缺点：,优点：,能把任何片段连接起来,操作繁琐； 外源片段难以回收； 同聚物尾巴影响外源基因表达。,非酶切位点,（2）衔接物（linker）连接,Linker：,用化学合成法合成的一段10-12bp的，具有一个或数个限制性内切酶识别位点的平末端双链寡核苷酸,GGAATTCC CCTTAAGG,EcoR I linker：,（1）多核苷酸激酶处理,（2）T4连接酶连接,（3）限制性内切酶消化,（4）目的片段与载体连接,（二） 人工加尾形成 “粘性末端”,（3）接头分子 （

4、adapter）连接法, adapter,一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）,Blunt-ended DNA,5p-GATCCCGG-OH3 3HO-GGCC-p5,BamHI adapter,P-,-P,5p-GATCCCGG- GGCC-,-CCGG -GGCCCTAG-P5,接头与接头以粘末端连接，影响与DNA片段的连接, 优点：,连上后就能用。, 缺点：,先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5端的磷酸，防止自我连接。, 防止自我连接,5p-GATCCCGG- GGCC-,CCGG GGCCCTAG-p5,Blunt-ended DNA,5p-GATCCCGG-3

5、 GGCC-p5,BamHI adapter,P-,-P,5HO-GATCCCGG- GGCC,CCGG -GGCCCTAG-OH5,5HO-GATCCCGG3 GGCC-OH5,nick缺口,nick缺口,HO-,-OH,CIP处理,T4 ligase,虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接 T4多核苷酸激酶处理使5磷酸化,三、PCR产物的连接,1.在引物的5端设计酶切位点,符合载体的多克隆位点；,（1）设计原则,（2）带酶切位点的引物的结构,5端保护碱基内切酶识别序列 3端1520bp与模板互补；,避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。,引物1,GCAGAATTC,互补序列,模板,Eco

6、RI位点,5-,-3,GCAGAATTC,互补序列,5-,-3,3,模板,GCAGAATTC,互补序列 PCR产物,5-,-3,3,复性,延伸,模板,模板,3,3,GCTAGCCGG,互补序列,模板,BamH I 位点,-5,3-,5,复性,延伸,模板,模板,3,3,GCTAGCCGG,互补序列,-5,3-,模板,5,GCTAGCCGG,PCR产物 互补序列,-5,3-,引物2,带酶切位点的PCR产物,GCAGAATTC,PCR产物,5-,-3,CCTAGGCGC,PCR产物,-5,3-,CGTCTTAAG,GGATCCGCG,EcoR I位点,BamH I位点,AATTC,PCR产物,5-,

7、-3,CCTAG,PCR产物,-5,3-,G,G,EcoR I,BamH I,两头各有一个粘性末端！,A,A,dNTP,T,T,dTTP,Taq DNA聚合酶,载体,PCR产物,TA,TA,三、PCR产物的连接,2. 与T载体直接连接,四、DNA体外连接应注意的事项,插入片断与载体的酶切位点互补,相同的粘性末端才能有效地连接。,尽量避免平端连接。,EcoRI,EcoRI,EcoRI,（1）用相同的酶切,（2）用同尾酶切,BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII,都产生GATC4个碱基的粘性末端。,2. DNA插入的方向正确,用双酶切,由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接

8、。,EcoRI,BamHI,EcoRI,BamHI,EcoRI,BamHI,3. 插入基因的开放阅读框（ORF）正确,（1）DNA定向插入,（2）起始密码,尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要注意。,ATGGAATTC,载体,ATGCGGAATTCT,插入片断,EcoRI,EcoRI,ATGGAATTC T,重组,但移码突变！,4. 防止载体自身环化连接,（1）提高插入片断的用量,连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。,（2）用碱性磷酸酶处理载体,载体切口的5磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。,5,3,载体,插入片断,第二部分 重组体导入受体细胞的原理与技术,一、

9、重组DNA导入大肠杆菌,（一）转化（transformation）,大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。,（三）转染（transfection）,受体菌直接捕获重组噬菌体DNA的过程。,（二）感染（transduction）,将以噬菌体DNA为载体的DNA重组分子包装成病毒颗粒，感染受体菌的过程。,（一）转化（transformation）,（1）Ca2+诱导转化法（heat shock）,（2）电穿孔转化法（electronporation）,（3）PEG介导的原生质体转化,（4）接合转化,制备感受态细胞,增加受体菌细胞膜的通透性,（1） Ca2+诱导转化法, 目的,感受态细胞：处于能吸收外源DN

10、A分子的生理状态的细胞,使用丧失了限制体系的大肠杆菌。如K12系列的大肠杆菌。,菌种,用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。,制备原理,其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态。,制备过程,培养大肠杆菌,OD600至0.3-0.4,On ice 5-10 min,4离心收集菌,用冰冷的60mMCaCl2重悬,4离心收集菌,4离心收集菌,分装、-70 冻存,用冰冷的60mMCaCl2重悬,On ice 30 min,用冰冷的60mMCaCl2重悬,1、将处于对数生长期的细菌置于0的CaCl2低渗溶液中，细胞

11、膨胀成球形，处于感受态； 2、将感受态细胞与DNA混合，Ca2+与DNA结合形成抗DNase的羟基-磷酸钙复合物，粘附于细胞表面； 3、经42短时间热激处理，细胞吸收DNA复合物； 4、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。, CaCl2法制备感受态细胞转化DNA的原理,10ng 载体DNA,100L 感受态细胞,冰浴30min,42 12min,加入1mL LB培养基 （Amp-）,37 振荡培养1h,10-100L转化液涂Amp平板,吸附DNA,摄入DNA,操作步骤：（p140）,转化率：106-108/g DNA,（2）电转化法,原理：在高压脉冲下，细菌细胞表面形成暂时性微孔，重

12、组DNA通过微孔进入细胞后，脉冲结束，细胞恢复原状。 实验简单，不需要制备特殊的感受态细胞,“感受态”：清洗处理，在低温下使细胞处于无离子区且有甘油或蔗糖等保护剂的悬液中，保证电击过程中细胞不被击穿而死亡。,转化率：1091010/ g DNA,LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6,冰浴15分钟，2C离心集菌,冰冷的10%甘油重悬菌体,2C离心集菌,冰冷的10%甘油重悬菌体,2C离心收集菌体,少量冰冷10%甘油重悬,分装成 50-300L,电转仪调为2.5kV,25F,脉冲控制器200-400,0.5g质粒DNA,On ice混合,加入1mLSOC培养液,37C中速震荡60分钟,10-1

13、00L转化液涂含抗菌素的平板,转化,电转化法,3.PEG介导的原生质体转化法 原理：PEG为细胞融合剂，可使细胞膜间或DNA与膜之间形成分子桥，从而有利于DNA分子的进入。 步骤： （1）取对数生长期的大肠杆菌细胞，用含有适量溶菌酶的等渗缓冲液剥除细胞壁，形成原生质体； （2）加入待转化的DNA和PEG等渗溶液，均匀混合，促进DNA进入细胞； （3）离心除去PEG，将菌体涂布在特殊的固体培养基上，再生细胞壁，最终得到转化细胞。,4. 接合转化,接合：指通过细菌细胞之间的直接接触导致DNA从 一个细胞转移至另一个细胞的过程。 原理：非接合型质粒由于缺少编码接合转移基因，不能直接通过细胞接合转化受

14、体细胞，但当同一细胞中共存一个含有接合功能的辅助质粒，则这些非接合型质粒通常也会被转移。 接合转化法（三亲本杂交接合转化法）：待转化的受体菌、含重组质粒DNA的供体菌、含有接合质粒的辅助菌。,（二） 感染,将以噬菌体DNA为载体的DNA重组分子包装成病毒颗粒，使其感染受体菌的过程称为感染；,体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，形成噬菌斑。,体外包装过程,受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。 （每g DNA能形成106噬菌斑）。,形成噬菌斑,通过受体菌细胞表面的DNA接受器位点（receptor site)，使带有外源基因的重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增。,（三） 转染,噬菌体DNA不经过蛋白包装成

15、病毒颗粒，用DNA连接酶使噬菌体环化，再通过质粒的转化方式导入受体菌的过程。,是转化的一种特殊形式,二、重组DNA导入真核细胞,（一）导入酵母细胞,原生质体转化 碱金属离子介导的完整细胞转化 PEG1000转化法 电击法,（二）导入植物细胞,（三）导入动物细胞,1. 利用原生质体进行转化,酵母,原生质体,感受态,酶去壁,CaCl2 PEG,插入外源基因的载体,共转化：将两个以上的基因同时导入感受态细胞的方法,转化,特点：操作周期长；转化率受再生率影响；共转化的原生质体占转化子总数的25%33%。,再生,PEG（聚乙二醇）使细胞壁具有通透性，允许DNA进入。 CaCl2使细胞膜具有通透性，允许D

16、NA进入。,酵母,0.1mol/L LiCl处理,感受态,2. 碱金属离子介导的完整细胞转化,热激,涂布选择性平板，筛选转化子,特点：吸收线性DNA能力明显大于环状DNA，两者相差80倍 转化率：103个 / g DNA；共转化现象极少,3. PEG1000转化,PEG处理酵母细胞，可获得类感受态，用于转化,毕氏酵母PEG1000转化法 （1）试剂 缓冲液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene glycol 缓冲液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35 缓冲液C：0.15

17、M NaCl，10mM Bicine，pH8.35 DMSO，-70保存 （2）待转化毕氏酵母的制备 接种环接种Pachia pastoris于YPD平板，30培养2d; 挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中，30振荡培养过夜； 取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养，待其OD值从0.1升到0.50.8； 室温下3000g离心收集酵母菌体，50ml缓冲液A洗涤一次； 重悬菌体于4ml缓冲液A中，按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中，每管加入11ulDMSO，混合后迅速于液氮中冷冻， -70保存 （3）毕氏酵母的转化 将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或

18、水中，直接加于冻结的酵母细胞中；加入担体DNA（40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA）以获得最大转化率； 37水浴孵育5min，中间混合样品12次； 取出离心管，加入1.5ml缓冲液B，彻底混匀； 30水浴孵育1h； 室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中； 离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中； 将所有转化液铺于选择性平板，于30孵育34天后，鉴定；,4. 电击转化,（1）适于原生质体和完整细胞 （2）转化率高，105个 / g DNA （3）单链转化率高于双链,二、重组DNA导入真核细胞,（一）导入酵母细胞,载体介导的转化（农

19、杆菌介导） DNA直接导入（基因抢法、电击法等） 种质系统法（花粉管通道法等）,（二）导入植物细胞,（三）导入动物细胞,（二）导入植物细胞,1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法,将目的基因插入到载体的T-DNA区，形成重组DNA,（二）导入植物细胞,1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法,将重组DNA转入含有Vir致病基因的农杆菌,（二）导入植物细胞,1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法,通过农杆菌侵染植物外植体,（二）导入植物细胞,1. 农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法,将含有外源目的基因的T-DNA整合到植物细胞基因组中，获得转基因植株,在饲养平皿的滤纸上培养2天,叶盘法的具体操作,优

20、点： 转化方法简单有效 转化的外源DNA结构完整、整合位点稳定 转化效率高,2、植物病毒介导的感染 植物细胞原生质体感染： 以双链DNA病毒-花椰菜花斑病毒作为载体，除去有关的致病基因，换上外源基因，体外包装成病毒颗粒，感染植物细胞原生质体，并由此再生成植株。,植物组织感染： 植物双生病毒（Geminiviruses）为一单链DNA病毒。,病毒载有的外源基因易被排斥出来或被消灭掉，插入外源基因的病毒容易失去感染力及宿主范围狭窄等问题有待解决，至今还没有真正可使用的载体病毒。,又称生物弹击法、微弹轰击法，借助高速金属微粒将DNA分子引入活细胞的转化技术。,金属微粒加速，进入受体细胞,3. 基因枪

21、法（gene gun）,CaCl2、亚精胺、PEG,混合,具体操作,缺点： 整合效率极低。,植物细胞,原生质体,纤维素酶和果胶酶,DNA,混合入 电击缓冲液,电击处理,愈伤组织,幼苗,分化,4. 电击法（电穿孔法）,选择培养,5、显微注射法 利用显微注射仪将外源DNA直接注入受体（游离细胞、原生质体、分生组织）的细胞质或细胞核中。 显微注射中的一个重要问题是必须把受体细胞进行固定。目前有三种方法： 琼脂糖包埋法: 多聚-L-赖氨酸粘连法： 吸管支持法：,优点： 方法简单、转化率高； 适用于各种植物和各种材料，无局限性； 整个操作过程对受体细胞无药物等毒害，有利于转化细胞的生长发育； 缺点： 工

22、作效率低，需要精细操作和精密仪器，难以进行大规模转化。,6、花粉管通道法 主要原理：授粉后，将外源DNA注入柱头，外源DNA能沿着花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞。 这一技术原理可以应用于任何显花植物。 简便、快捷。,二、重组DNA导入真核细胞,（一）导入酵母细胞,1. 磷酸钙沉淀法 2. 脂质体介导法 3. 显微注射法 4. DEAE-葡萄糖转染法,（二）导入植物细胞,（三）导入动物细胞,原理：,（三）导入动物细胞,1. 磷酸钙沉淀法,通过磷酸钙-DNA共沉淀，将颗粒悬浮液滴入细胞培养皿中，细胞膜形成吞噬泡，磷酸钙局部溶解膜结构，将外源基因导入哺乳动物细胞