实验室玻璃器皿、培养基的灭菌技术

1、玻璃器皿、培养基的灭菌技术,概念,消毒：杀死物体上病原微生物的方法,并不一定,能杀死含芽胞的细菌或非病原微生物。,灭菌：杀灭物体上所有微生物的方法。,无菌：不存在活菌的意思。,防腐：防止或抑制体外细菌生长繁殖的方法。,一、消毒与灭菌的方法,?,?,物理的方法：,加热,、过滤、辐射,化学的方法：用化学试剂抑制或杀灭微生物。,主要破坏细菌代谢机能。如重金属离子，磺胺,类药物及抗生素等。,物理方法,?,?,干热灭菌又称热空气灭菌，是利用高温使微生,物细胞内的蛋白质凝固变性的原理。,湿热灭菌法是指用饱和水蒸气、沸水或流通蒸,汽进行灭菌的方法，由于蒸汽潜热大，穿透力,强，容易使蛋白质变性或凝固，所以该法

2、的灭,菌效率比干热灭菌法高。,物理方法,?,辐射：利用辐射进行灭菌消毒，可以避,免高温灭菌或化学药剂消毒的缺点，所,以应用越来越广。,物理方法,1,）紫外线：,波长,200300m,的紫外线,具有杀,菌作用。,杀菌机理：干扰,DNA,的复制与转录。,特点：穿透力不大。,距照射物,1.2m,为宜,。,应用范围：空气消毒。例如，手术室、传染病,房、细菌实验室不耐热物品的表面消毒。,注意事项：对眼睛和皮肤有刺激作用。,物理方法,2,）电离辐射：包括高速电子、,X,射线和,射线,杀菌机理：产生游离基,破坏,DNA,。,应用范围：一次性医用塑料制品的消毒食品的,消毒不破坏其营养成分,物理方法,?,过滤：

3、采用机械方法，设计一种滤孔比细菌还小的筛,子，做成各种过滤器。通过过滤，只让液体培养基从,筛子中流下，而把各种微生物菌体留在筛子上面，从,而达到除菌的目的。,?,这种灭菌方法适用于一些对热不稳定的体积小的液体,培养基的灭菌以及气体的灭菌。,它的最大优点是不破坏培养基中各种物质的化学成分。,但是比细菌还小的病毒仍然能留在液体培养基内，有,时会给实验带来一定的麻烦。,?,过滤注意事项：,1,、压力适当；,2,、无菌条件下进行；,3,、防止渗透现象。,化学方法,一般化学药剂无法杀死所有的微生物，而只能,杀死其中的病原微生物，所以是起消毒剂的作,用，而不是灭菌剂。,各种消毒剂的种类,类别,酚类,醇类,

4、氧化剂,重金属盐,氧化剂,表面活性剂,染料,作用机制,常用种类,蛋白变性，细胞膜损伤,石炭酸,蛋白变性,氧化、蛋白沉淀,氧化、蛋白酶变性,氧化、蛋白沉淀,蛋白变性，细胞膜损伤,干扰氧化、抑制繁殖,乙醇,高锰酸甲,红汞、硫柳汞,过氧乙酸、碘酒,新洁而灭,龙胆紫,各种消毒剂的应用,种类,石炭酸,乙醇,高锰酸甲,红汞,硫柳汞,过氧乙酸,碘酒,新洁而灭,使用浓度,3%5%,3%5%,3%5%,3%5%,3%5%,3%5%,3%5%,3%5%,用途,地面、器具表面、皮肤消毒,皮肤、体温计消毒,皮肤、尿道、蔬菜、水果消毒,皮肤、粘膜、小创伤消毒,皮肤消毒、手术部位消毒,塑料、玻璃器材消毒,皮肤消毒,手术洗

5、手、浸泡手术器械,干热灭菌,?,适用范围：,用于高温下不损坏、不变质、不蒸发物品的灭,菌；用于不耐湿热的器械的灭菌；用于蒸汽或,气体不能穿透物品的灭菌，如玻璃、油脂、粉,剂（遇水结块）和金属等制品的消毒。,干热灭菌,?,干热灭菌法又分为烧灼和焚烧、干烤、红外线、,微波等几种方法。,干热灭菌,?,?,（,1,）烧灼和焚烧：烧灼是直接用火焰杀死微,生物，适用于实验室的金属器械（镊、剪、接,种环、接种针等）、玻璃试管口和瓶口等不怕,热的器材灭菌。,焚烧是彻底的消毒方法，但只限于处理废弃的,污染物品，如无用的衣物、纸张、垃圾等。焚,烧应在专用的焚烧炉内进行。,干热灭菌,?,?,（,2,）干烤：在干烤箱

6、内进行，加热至,160,170,维持,2,小时，,可杀灭包括芽胞在,内的所有微生物。,此方法适用于耐高温的玻璃器皿、瓷器、玻质,注射器等。,干热灭菌,?,（,3,）红外线：是波长为,770nm,1000m,的,电磁波，以,1m,10m,波长的热效应最强。,亦被认为一种干热灭菌。红外线由红外线灯泡,产生,不需要经空气传导，所以加热速度快，,但热效应只能在照射到的表面产生，因此不能,使一个物体的前后左右均匀加热。红外线的杀,菌作用与干热相似，利用红外线烤箱灭菌的所,需温度和时间亦同于干烤。多用于医疗器械的,灭菌。,干热灭菌,?,?,红外线灭菌注意事项：,人受红外线照射较长会感觉眼睛疲劳及头疼；,长

7、期照射会造成眼内损伤。因此，工作人至少,应戴能防红外线伤害的防护镜。,干热灭菌,?,（,4,）微波：波长为,1mm,1000mm,的,电磁波统称为微波，可穿透玻璃、塑料,薄膜与陶瓷等物质，但不能穿透金属表,面。微波能使介质内杂乱无章的极性分,子在微波场的作用下，按波的频率往返,运动，互相冲撞和磨擦而产生热，介质,的温度可随之升高，因而在较低的温度,下能起到消毒作用。,干热灭菌,?,一般认为其杀菌机理除热效应以外，还,有电磁共振效应，磁场致力效应等的作,用。消毒中常用的微波有,2450MHZ,与,915MHZ,两种。微波照射多用于食品加,工。在医院中可用于检验室用品、非金,属器械、无菌病室的食品

8、食具、药杯及,其它用品的消毒。,干热灭菌,?,微波长期照射可引起眼睛的晶状混浊、,睾丸损伤和神经功能紊乱等全身性反应，,因此必须关好门后再开始操作。,干热灭菌,?,?,?,?,干热灭菌的注意事项：,待灭菌的物品在干热灭菌前应先洗净，防止造,成灭菌失败或污物炭化；,玻璃器皿灭菌前应洗净并干燥；,灭菌时勿与烤箱底部及四壁接触，灭菌后要待,温度降到,40,以下再开箱，以防止爆裂；,?,?,物品包装不能过大，不超过,10,厘米,10,厘米,20,厘米，物品不能超过烤箱的高度的,2/3,，,物品间应留有充分的空间（可放入一只手）；,油剂、粉剂的厚度不得超过,0.6,厘米；凡士林,布条厚度不得超过,1.3

9、,厘米。,温度高于,170,时，有机物会炭化，故有机物,品灭菌时，温度不可过高。,干热灭菌,?,?,?,?,电热恒温干燥箱（俗称“烤箱”）的使用,1.,装料：将带灭菌的物品包扎好放入电热恒温,干燥箱。,注意物品不能摆得太挤，以免影响热空气流通。,用纸包扎的物品不能接触内壁。,2.,升温：接通电源，打开排气孔，排除箱内湿,空气；旋动恒温调节器，让温度逐渐上升。当,温度升至,100,摄氏度，关闭排气孔。,干热灭菌,?,?,?,3.,恒温：当温度升到,160,摄氏度时，利用恒温,调节器的自动控制，保持温度,1h,。灭菌物品用,纸包扎或带有棉塞时温度不能超过,170,摄氏度。,4.,降温：达到规定的时

10、间后，切断电源，自然,降温。,5.,取料：待箱内温度降到,60,摄氏度，打开箱门，,取出灭菌物品。箱内温度未降到,70,摄氏度，切,勿打开箱门，以免骤然降温导致玻璃器皿破裂。,湿热灭菌,湿热灭菌,?,适用范围：,用于耐高温、耐高湿的医疗器械,和物品的灭菌。,湿热灭菌,?,湿热灭菌法分为煮沸法、流通蒸汽灭菌法、间,隙灭菌法、巴氏消毒法、高压蒸汽灭菌法等几,种灭菌方法。,湿热灭菌,?,（,1,）煮沸法：煮沸,100,，,5,分钟，能杀死一,般细菌的繁殖体。许多芽胞需经煮潮,5,6,小时,才死亡。水中加入,2%,碳酸钠，可提高其沸点,达,105,。既可促进芽胞的杀灭，又能防止金,属器皿生锈。煮沸法可

11、用于饮水和一般器械,（刀剪、注射器等）的消毒。,湿热灭菌,?,?,（,2,）流通蒸汽灭菌法：利用,100,左右的水,蒸汽进行消毒，一般采用流通蒸汽灭菌器（其,原理相当于我国的蒸笼），加热,15,到,39,分钟，,可杀死细菌繁殖体。消毒物品的包装不宜过大、,过紧，这样以利于蒸汽穿透。,凡不耐高温的物质，如糖类、明胶、血清、牛,乳及鸡蛋等可用此方法灭菌。,湿热灭菌,?,（,3,）,间歇灭菌法：又称分段灭菌法。适用于不耐热培,?,养基的灭菌。,方法是：将待灭菌的培养基在,100,下蒸煮,30-60min,，,以杀死其中所有微生物的营养细胞，然后置室温或,20-,30,下保温过夜，诱导残留的芽胞萌发，

12、第二天再以,同法蒸煮和保温过夜，如此连续重复,3,天，即可在较,低温度下达到彻底灭菌的效果。例如，培养硫细菌的,含硫培养基就是应用间歇灭菌法灭菌，因为其中的元,素硫经常规的高压灭菌,(12l,),后会发生熔化，而在,100,的温度下则呈结晶状。,?,?,?,间歇灭菌法的注意事项：,使用间歇法灭菌时必须在灭菌物里外都达到,100,后开始计算灭菌时间。,间歇法灭菌时应在每次加热后，迅速降温，然,后在室温放置,24h,，再第二次加热。如果降温,慢，往往使未杀死的杂菌大量滋长，反面导致,灭菌物变质，特别是包装过大时，靠近中心部,分更易发生这种情况。,湿热灭菌,?,（,4,）巴氏消毒法（,Pasteur

13、ization,）：有些食,物会因高温破坏营养成分或影响质量，如牛奶、,酱油、啤酒等，所以只能用较低的温度来杀死,其中的病原微生物，这样既保持食物的营养和,风味，又进行了消毒，保证了食品卫生。该法,一般在,62,C,，,30,分钟既可达到消毒目的。此,法为法国微生物学家巴斯德首创，故名为巴氏,消毒法。,?,巴氏消毒法是一种低温消毒法，具体的处理温,度和时间各有不同，,一般在,60-85,下处理,15-,30min,。,具体的方法可分两类，第一类是较老,式的，称为低温维持法，例如在,63,下保持,30min,可进行牛奶消毒；另一类是较新式的，,称为高温快速法，用于牛奶消毒时只要在,85,下保持,

14、5min,即可。但是巴氏消毒法不能杀灭,引起,Q,热的病原体,-,伯氏考克斯氏体,(,一种立克,次氏体,),。,湿热灭菌,?,（,5,）高压蒸汽灭菌法：压力蒸汽灭菌是,在专门的压力蒸汽灭菌器中进行的，是,热力灭菌中使用最普遍、效果最可靠的,一种方法。其优点是穿透力强，灭菌效,果可靠，能杀灭所有微生物。,湿热灭菌,压力蒸汽灭菌器分类：,?,根据排放冷空气的方式和程度不同，分,为下排气压力蒸汽灭菌器和预真空压力,蒸汽灭菌器。,?,干热和湿热两者比较,?,在同样的温度下，温热的杀菌效果,比干热好，其原因有：,?,蛋白质凝固所需的温度与其含水,量有关，含水量愈大，发生凝固所,需的温度愈低。湿热灭菌的菌

15、体蛋,白质吸收水分，因较同一温度的干,热空气中易于凝固。,两者比较,?,温热灭菌过程中蒸气放出大量潜,热，加速提高湿度。因而湿热灭菌,比干热所要温度低，如在同一温度,下，则湿热灭菌所需时间比干热短。,湿热的穿透力比干热大，使深部,也能达到灭菌温度，故湿热比干热,收效好。,高压蒸汽灭菌器的基本构造,1.,外锅,或称“套层”，供贮存蒸汽用，,连有用电加热的蒸汽发生器，并有水位,玻管以标志盛水量。外锅的外侧一般包,有石棉或玻璃棉绝缘层以防止散热。如,直接使用由锅炉接入的高压蒸汽，则外,锅在使用时充满蒸汽，作为内锅保温。,2.,内锅,或称灭菌室，是放置灭菌物的空,间可配制铁蓖架以分放灭菌物。,?,?,

16、3.,压力表,内外锅各装一只，老式的压力表上,标明三种单位：公斤压力单位,(kg/cm2),，英制,压力单位,(1b/in2),和温度单位,(,),，便于灭菌时,参照。现在的压力表用,MPa,表示。,4.,温度计,可分为两种，一种是直接插入式的,水银温度计，装在密闭的铜管内，焊插在内锅,中另一种是感应式仪表温度计，其感应部分,安装在内锅的排气管内，仪表安装于锅外顶,部便于观察。,?,?,5.,排气阀,一般外锅、内锅各一个，用于排除,空气。新型的灭菌器多在排气阀外装有汽液分,离器,(,或称疏水阀,),内有由膨胀盒控制的活塞。,利用空气、冷凝水与蒸汽之间的温差控制开关，,在灭菌过程中，可不断地自动

17、排出空气和冷凝,水。,6.,安全阀,或称保险阀利用可调弹簧控制活,塞，超过额定压力即自动放气减压。通常调在,额定压力之下，略高于使用压力。安全阀只供,超压时安全报警之用，不可在保温时用作自动,减压装置。,?,7.,热源,除直接引入锅炉蒸汽灭菌外，都具有,加热装置。近年来的产品以电热为主，即底部,装有调控电热管，使用比较方便。有些产品无,电热装置，则附有打气煤油炉等。手提式灭菌,器也可用煤炭炉作为热源。,第二节,实验内容,一、实验目的,?,了解湿热灭菌的原理，学习并掌握蒸汽灭菌的,操作方法与注意事项。,二、实验原理,?,?,高压蒸汽灭菌是微生物学实验、发酵工业生产、,以及外科手术器械等方面常用的

18、一种灭菌方法，,属于湿热灭菌。,一般培养基、玻璃器皿、无菌水、无菌缓冲液、,金属用具、接种室的实验服及传染性标本都可,采用此法灭菌。,?,将待灭菌的物体放置在盛有适量水的高压蒸汽,灭菌锅内。把锅内的水加热煮沸，并把其中原,有的冷空气彻底驱尽后将锅密闭。再继续加热,就会使锅内的蒸汽压逐渐上升，从而温度也随,之上升到,100,以上。为达到良好的灭菌效果，,一般要求温度应达到,121,(,压力为,0.1MPa),，,时间维持,15-30min,。也可采用在较低的温度,(115,，即,0.075MPa),下维持,35min,的方法。,?,高压蒸汽灭菌是依据水的沸点随水蒸汽压的增,加而上升，加压是为了提

19、高水蒸汽的温度。,高压蒸汽灭菌时常用的灭菌压力、温度与时间,蒸,汽,压,力,蒸汽温度,(,C),112.6,115.2,121.0,灭菌时间,（,min,）,30,20,20,MPa,0.055,0.069,0.103,Kgf/cm,2,0.56,0.70,1.00,Lbf/in,2,8.00,10.00,15.00,?,高压蒸汽灭菌器是一个能耐压、同时可以密闭,的金属锅，有立式、卧式、手提式三种。热源,可以用蒸汽、煤气或电源。灭菌器上装有表示,锅内温度和压力的温度计、压力表。灭菌锅还,有排气口、安全活塞。如压力超过一定限度，,活塞的阀门便自动打开，放出过多的蒸汽。,?,高压蒸汽灭菌技术关键是

20、在压力上升之前需将,锅内冷空气排尽。若锅内未排除的冷空气滞留,在锅中，压力表虽指示,0.1MPa,，但锅内温度,实际只有,100,摄氏度，高压结束会造成灭菌不,彻底。,空气排除程度与温度关系,压力表,读数,MPa,0.034,0.069,0.103,0.138,0.172,0.206,灭菌器内温度,/,C,未排除,空,气,72,90,100,109,115,121,排,除,排,除,排,除,1/3,空气,1/2,空气,2/3,空气,90,94,100,100,109,115,121,126,105,112,118,124,128,109,115,121,126,130,完全排,除空气,109,1

21、15,121,126,130,135,影响灭菌的因素,?,a.,不同的微生物或同种微生物的不同菌龄对高,温的敏感性不同。多数微生物的营养体和病毒,在,5065,C,，,10,分钟就会被杀死；但各种孢,子、特别是芽孢最能抗热，其中抗热性最强的,是嗜热脂肪芽孢杆菌，要在,121,C,，,12,分钟,才被杀死。对同种微生物来讲，幼龄菌比老龄,菌对热更敏感；,影响灭菌的因素,b.,微生物的数量多少显然会影响灭菌的效果，数,量越多，热死时间越长；,c.,培养基的成分与组成也会影响灭菌效果。一般,地讲，蛋白质、糖或脂肪存在，则提高抗热性，,pH,在,7,附近，抗热性最强，偏向两极，则抗热,能力下降，而不同

22、的盐类可能对灭菌产生不同,的影响；固体培养基要比液体培养基灭菌时间,长。,?,?,灭菌时的过高温度常对培养基造成的主要不良,影响如下：,（,1,）出现混浊、沉淀,(,天然培养基成分加热可,以沉淀出大分子多聚合物；培养基中,Ca,、,Mg,、,Fe,、,Zn,等阳性离子与培养基中的可溶性磷酸,盐共热沉淀,),。,?,（,2,）营养成分破坏或改变（酸度较高时淀粉、,蔗糖、乳糖或琼脂灭菌过程易水解；,pH7.5,、,0.1MPa,灭菌,20min,，葡萄糖破坏,20%,、麦芽,糖破坏,50%,，若培养基中有磷酸盐共存，葡萄,糖转变成酮糖类物质，培养液由淡黄色变为红,褐色，破坏更为严重）。,?,?,（

23、,3,）,pH7.2,时培养基中的葡萄糖、蛋白胨、,磷酸盐在,0.1MPa,灭菌,15min,以上可产生对微,生物生长的某种抑制物。,（,4,）高压蒸汽灭菌后培养基,pH,下降,0.1-0.2,。,?,（,5,）高压蒸汽灭菌过程会增加冷凝水，降低,培养基成分浓度。对于前三种不良影响，可采,用低压灭菌（如在,0.056MPa,、,30min,灭菌葡,萄糖溶液），或将培养基几种成分分别灭菌，,临用前无菌混合（如磷酸盐与,Ca,、,Mg,、,Zn,、,Cu,等阳性离子溶液）的方法，特殊情况时可,采用间歇灭菌、过滤除菌（如维生素溶液）。,工业发酵生产中常采用连续加压灭菌法（,135-,140,C,，,

24、5-15,秒）和连续蒸煮法。,三、实验材料,?,?,高压灭菌器,待灭菌的培养基、无菌水、已包好的培养皿、,移液管、玻璃涂抹棒等及待灭菌空试管、锥形,瓶等玻璃器皿。,四、实验内容,?,?,?,?,?,（一）灭菌操作,1.,向锅内加水,打开灭菌锅盖，向锅内加适量水。水量不足，,灭菌锅易蒸干。,2.,放入待灭菌物品,将带灭菌物品放入灭菌桶内，物品不要放得太,紧和紧靠锅壁，以免影响蒸汽流通和冷凝水顺,壁流入灭菌物品。,?,?,3.,盖好锅盖,将盖上的软管插入灭菌桶的槽内，有利于罐内,冷空气自下而上排出，然后加盖，上下螺栓口,对齐，采用对角方式均匀旋紧螺栓，使锅密闭。,?,?,4.,排放锅内冷空气及升温

25、灭菌,打开放气阀，加热，自锅内开始产生蒸汽后,3min,再关紧放气阀（或喷出气体不形成水,雾），此时蒸汽已将锅内的冷空气由排气孔排,尽，控制热源，维持所需压力和温度，并开始,计时，一般培养基控制在,0.1MPa,灭菌,20min,；,含糖等成分培养基控制在,0.056MPa,灭菌,30min,或,0.07MPa,灭菌,20min,，,然后关闭热源，,停止加热，压力随之逐渐降低。,5.,灭菌完毕降温及后处理,?,待压力降至,0,时，慢慢打开放气阀，开盖，立,即取出灭菌物品，但在压力未完全降至,0,处前，,不能打开锅盖，以免培养基沸腾将棉塞冲出；,也不可用冷水冲淋灭菌锅迫使温度迅速下降。,所灭物品

26、开盖后立即取出，以免凝结在锅盖和,容器上的水滴弄湿包装纸或落到被灭菌物品上，,增加染菌率。斜面培养基自锅内取出后要趁热,摆成斜面，灭菌后的空培养皿、试管、移液管,等需烘干或晾干。若连续使用高压锅，每次需,补足水分，灭菌完毕，除去锅内剩余水分，保,持灭菌锅干燥。,6,、注意事项,6.1,灭菌前,?,清洗：将物品彻底清洗干净，物品洗涤后，应,干燥并及时包装。,?,包装：包装材料应允许物品内部空气的排出和,蒸汽的透入。,物品捆扎不宜过紧，外用化学指示胶带贴封，,灭菌包每大包内和难消毒部位的包内放置化学,指示物。,?,?,?,?,装载,：下排气灭菌器的装载量不得超过柜室,内容量的,80%,；预真空灭菌器的装载量不得超,过柜室容积,90%,。,应尽量将同类物品放在一起灭菌，若必须将不,同类物品装放在一起，则以最难达到灭菌物品,所需的温度和时间为准。,物品装放时，上下左右相互间均应间隔一定距,离以利蒸汽置换空气。,?,?,金属包应平放，盘、碟、碗应处于竖立的位置；,纤维织物应使折叠的方向与水平面成垂直状态；,玻璃瓶等应开口向下或侧放以利蒸汽进入和空,