实验13-琼脂糖凝胶电泳的原理和方法

1、琼脂糖凝胶电泳的,原理和方法,一、电泳方法的分类,按支持物的物理性状不同，区带电泳可为：,?,滤纸及其他纤维（如醋酸纤维、玻璃纤维、,聚氯乙烯纤维）,薄膜,电位；,?,粉末,电泳，如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电,泳；,?,凝胶,电泳，如琼脂、,琼脂糖,、硅胶、淀粉,胶、聚丙烯酰胺凝胶等；,?,丝线,电泳，如尼龙丝、人造丝电泳。,1,按支持物的装置形式不同，区带电泳可为：,?,平板式,电泳，支持物水平放置，是最常用,的电泳方式；,?,垂直板式,电泳，聚丙烯酰胺凝胶常做成垂,直板式电泳；,?,垂直柱式,电泳，聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳,即属于此类；,?,连续液动,电泳，首先应用于纸电泳，将滤,纸垂直竖立，

2、两边各放一电极，溶液自顶端,向下流，与电泳方向垂直。,2,二、琼脂糖凝胶电泳,概念：,以,琼脂糖凝胶,作支持体的电泳方式。,天然琼脂（,agar,）,:,又名琼胶、菜燕、冻粉，从石花菜及,其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。,琼脂糖（,agarose,）,琼脂胶（,agaropectin,）,3,天然琼脂,(agar),是一种多聚糖，主要由,琼,脂糖,(,约占,80%),及,琼脂胶,组成。琼脂糖是由,半乳糖及其衍生物构成的,中性物质,，不带电,荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的,强酸,性多糖,，由于这些基团带有电荷，在电场作,用下能产生较强的,电渗,现象，加之硫酸根可,与某些蛋白质作用而影

3、响电泳速度及分离效,果。,4,D-,半乳糖,3,，,6-,脱水,-L-,半乳糖,琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作,用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型,凝胶。,5,6,7,琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其,优点,(1),琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不,(2),琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大,(,约占,98-99%),，,近似自由电泳，样品扩散度较自由电泳,小，对样品吸附,(3),琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接,(4),电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。,8,琼脂糖凝胶电泳的,缺点,：,(1),机械强度差，易破碎，浓度不能太低。,(2),易被细菌

4、污染，不易保存，临用前配制。,(3),琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须,立即固定染色。,(4),与,PAGE,相比，分子筛作用小，区带少。,9,目前，琼脂糖凝胶电泳常用于分离、鉴定核酸，,如,DNA,鉴定，,DNA,限制性内切酶图谱制作等。由,于这种方法操作方便，设备简单，需样品量少，分,辨能力高，已成为基因工程研究中常用实验方法之,一。,琼脂糖也可用作为电泳支持物，分离蛋白质和,同工酶。将琼脂糖电泳与免疫化学相结合，发展成,免疫电泳技术，能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体,系，由于建立了超微量技术，0.1g蛋白质就可检,出。,10,三、,DNA,的琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳对核酸的分

5、离作用主要,依据它们的相对分子质量及分子构型，同,11,1.,核酸分子大小及琼脂糖的浓度的关系,(1)DNA,分子的大小：,DNA,分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应,和分子筛效应。,DNA,分子在高于等电点的,pH,溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一,定的电场强度下，,DNA,分子的迁移速度取决于,分子筛效应，即,DNA,分子本身的大小和构型。,12,13,在凝胶中，,DNA,片段迁移距离,(,迁移率,),与碱,基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准,物移动的距离与未知片段的移动距离进行比较，,便可测出未知片段的大小。,但是当,DNA,分子大小超过,20kb,时，普通琼脂,糖凝胶就很

6、难将它们分开。此时电泳的迁移率,不再依赖于分子大小，因此，应用琼脂糖凝胶,电泳分离,DNA,时，分子大小不宜超过此值。,14,(2),琼脂糖的浓度：,不同大小的,DNA,需要用不同浓度的琼脂糖凝,胶进行电泳分离,如下表所示,:,15,2.,核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系,不同构型,DNA,的移动速度次序为：,共价闭环,DNA,(covalently closed circular,，简称,cccDNA),直线,DNA,开环的双链环状,DNA,。当琼脂糖浓度太高,时，环状,DNA(,一般为球形,),不能进入胶中，相对迁移率,为,0(Rm=O),，而同等大小的直线双链,DNA(,刚性棒状,),

7、则可以,长轴方向前进,(Rm,O),，由此可见，这,3,种构型,的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，但同时，也受到电,流强度、缓冲液离子强度等的影响。,16,3.,电泳方法,(1),用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及,水平型,(,平板型,),。水平型电泳时，凝胶板完全浸泡,在电极缓冲液下,1-2mm,，故又称为潜水式。目前,更多用的是后者，因为它制胶和加样比较方便，电,泳槽简单，易于制作，又可以根据需要制备不同规,17,(2),缺少离子时，电流太小，,DNA,迁移慢；相反，,高离子强度的缓冲液由于电流太大会大量产热,，,严重时，会造成胶熔化和,DNA,常用的电泳缓冲液有,EDTA(pH8.

8、0),和,Tris-,乙酸,(,TAE),，,Tris-,硼酸,(TBE),或,Tris-,磷酸,(TPE),等,，浓,度约为,50mmol/L(pH7.5-7.8),。电泳缓冲液一,般都配制成浓的贮备液，临用时稀释到所需倍数。,TAE,缓冲能力较低，后两者有足够高的缓冲能力,，因此更常用。,TBE,浓溶液长期贮存会出现沉,淀,，为避免此缺点，室温下贮存,5,溶液，用时稀释,1,0,倍。,0.5,18,(3),以稀释的电极缓冲液为溶剂，用沸水浴或微波,炉配制一定浓度的溶胶，冷却至,45-50,时灌,入水平胶框或垂直胶膜，插入梳子，自然冷却,。,(4),DNA,样品用适量,Tris-EDTA,缓

9、冲液溶解，缓,冲溶解液内含有,0.25%,溴酚蓝或其他指示染料,，,含有,10%-15%,蔗糖或,5%-10%,甘油，以增,加其比重，使样品集中。为避免蔗糖或甘油可,能使电泳结果产生,U,形条带，可改用,2.5% Fico,ll(,聚蔗糖,),代替蔗糖或甘油。,19,(5),琼脂糖凝胶分离大分子,DNA,实验条件的研究结果表,明：在低浓度、低电压下，分离效果较好。在低电压,条件下，线性,DNA,分子的电泳迁移率与所用的电压呈,正比。但是，在电场强度增加时，较大的,DNA,片段迁,移率的增加相对较小。因此随着电压的增高，电泳分,辨率反而下降，为了获得电泳分离,DNA,片段的最大分,辨率，电场强度

10、不宜高于,5V/cm,电泳系统的温度对于,DNA,在琼脂糖凝胶中的电泳行,为没有显著的影响。通常在室温下进行电泳，只有当,凝胶浓度低于,0.5%,时，为增加凝胶硬度，可在4，,常用荧光染料溴乙锭,(EB),染色，在紫外光下观察,DN,A,条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出,照片，并进行有关的数据分析。,(6),20,注意,!,21,溴,化乙,锭,（,EB,）,为,强致癌,剂,，操作,时应,戴手,套，,尽,量,减,少台面,污,染。,目前,实验,室一般用相,对,安全的,GoldenView,等核,酸,荧,光染料代替。,四、印迹转移电泳,生物化学与分子生物学的研究工作经常需要对电泳分离,后

11、的,DNA,进行分子杂交，但琼脂糖不适合于进行杂交操作，,1975,年，,Southern,创造了将,DNA,区带原位转移到硝酸基,纤维素膜,(NC,膜,),上，再进行杂交的方法，被称为,Southern,印迹法,。随后，,Alwine,等将类似方法用于,RNA,印迹，被戏,称为,Northern,印迹,，,1979,年,Towbin,等设计了将蛋白质从,凝胶转移到硝酸纤维素膜的装置，将蛋白质转移到膜上，再,与相应的抗体等配体反应，被戏称为,Western,印迹,，这种装,置将膜和凝胶、滤纸等制成夹心饼干状，用低电压高电流电,泳完成转移。,1982,年,Reinhart,等用电转移法将等电聚焦

12、后,的蛋白质区带从凝胶转移到特定膜上,，,称,Eastern,印迹,22,目前国内外有多种核酸、蛋白质印迹转移的电泳装置出售，,使印迹转移速度快、效率高、重复性好，应用更加广泛，仪器,的使用方法可参照厂家说明书。聚丙烯酰胺凝胶也可用于印迹,转移电泳，但转移蛋白质时，凝胶中不可含有,SDS,、尿素等变,性剂。用于转移电泳的支持膜亦有多种选择，近些年用尼龙膜,较多，因为尼龙膜机械性能好，烘烤不变脆，使用时比硝酸纤,进行印迹转移电泳时，要注意缓冲液的离子强度要低，,pH,要远离,pI,，使蛋白质带有较多电荷，一般用稳定性较好的,Tris-,缓冲体系。还要注意凝胶与支持膜之间不能有气泡。适当提高,电压

13、或电流可以提高转移速度，但亦会增加热效应，故电压或,电流不可过高。,23,24,25,五、交变脉冲电场凝胶电泳,一般琼脂糖凝胶电泳只能分离小于,20kb,的,DNA,。,这是因为在琼脂糖凝胶中，,DNA,分子的有效直径超,过凝胶孔径时，在电场作用下，迫使,DNA,变形挤过,筛孔,，而沿着泳动方向,伸直,，因而分子大小对迁移,率影响不大。如此时,改变电场方向,，则,DNA,分子必,须改变其构象，,沿新的泳动方向伸直,，而转向时间,与,DNA,分子大小关系极为密切。,26,1983,年，,Schwartz,等人根据,DNA,分子弹性弛豫,时间,(,外推为零的滞留时间,),与,DNA,分子大小有关的

14、,特性，设计了脉冲电场梯度凝胶，交替采用两个垂,直方向的不均匀电场，使,DNA,分子在凝胶中不断改,变方向，从而使,DNA,按分子大小分开。后来，,Carle,等改进了电泳技术，并发现周期性的反转换电场,(periodic inversion of the electric field),亦能使大,分子,DNA,通过电泳分开。电泳系统是由一个水平式,电泳槽和两组独立，彼此垂直的电极组成，一组电,极负极为,N,，正极为,S,；另一组负极为,W,，正极为,E,。,27,一块正方形琼脂糖凝胶板,(10cm,10cm,或,20cm,20cm),呈,45,置于中央，电场在,N-S,和,W-E,之间,交替

15、建立。电场交替改变的时间长短与欲分离的,DNA,分子,大小有关。电泳时，,DNA,分子处在连续间隔交替的电场中。,首先向,S,极移动，然后改向,E,极。在每次电场方向改变时，,DNA,分子就要有一定的时间松弛，改变形状和迁移方向。,只有当,DNA,分子达到一定构型后，才能继续前进。,DNA,分子净移动方向与加样线,(,图中点线,),垂直，使样品中各组,分沿同一泳道形成各自的区带。交变脉冲电泳可有效分离,数百万,bp,的大分子,DNA,。较新式的仪器电极间的,角度和,28,六、血浆脂蛋白琼脂糖凝胶电泳,按电泳法分：,乳糜微粒（,CM,）,?,-,脂蛋白,（,?,-,位）,前,?,-,脂蛋白（,?,2,-,位）,按超速离心法分：,乳糜微粒,CM,(,0.96,),极低密度脂蛋白,VLDL(0.96,?,1.006),低密度脂蛋白,LDL,(1.019,?,1.063),?,-,脂蛋白,（,?,