细胞培养产品概述-普诺赛.pptx

1、细胞培养产品概述,报告人：刘亚 时 间：2015.10.23,1 细胞体外培养,指从体内组织取出细胞在体外模拟体内环境下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养的培养物可以是单个细胞，也可以是细胞群。,2 细胞体外培养的条件,营养成分 渗透压 温度 PH 气相 无菌无毒的细胞培养环境,2.1 细胞体外生存的营养条件,（1）水 溶剂、热稳定性、导热、表面张力； 培养用水电阻率1106。 （2）氨基酸 20种氨基酸必须氨基酸、非必须氨基酸； 培养基中都含有必须氨基酸； 谷氨酰胺缺乏会引起细胞生长不良甚至死亡； 溶液中不稳定，容易分解。 如细胞生长不良，需在培养液中补加谷氨酰胺，终

2、浓度在14mmol/L。,（3）碳水化合物 葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠等。 葡萄糖主要的能源物质，细胞对葡萄糖的吸收能力最高。 丙酮酸钠葡萄糖消耗殆尽时，可替代葡萄糖提供能量。,2.1 细胞体外生存的营养条件,（4）无机盐类 细胞生长所必需； 维持渗透压平衡； 维持酸碱平衡磷酸盐、碳酸盐等； Ca2+组织内部细胞之间相互粘连起重要作用； Mg2+细胞间质重要成分，利于细胞间相互稳定。,2.1 细胞体外生存的营养条件,（5）维生素 脂溶性维生素：A、D、E、K； 水溶性维生素：C、B1、B2、B6、B12、生物素、叶酸、烟酰胺、泛酸、吡哆醇、核黄素、硫胺素等； 参与构成各种酶的活性基团成分

3、，参与细胞生存和代谢。 （6）促生长因子及激素 对于维持细胞的功能、保持细胞的状态具有十分重要的作用。 如胰岛素，它能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸； 氢化可的松可促进表皮细胞的生长； 泌乳素有促进乳腺上皮细胞生长作用等。,2.1 细胞体外生存的营养条件,2.2 渗透压,细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养细胞对渗透压有一定耐受性； 不同动物细胞最适渗透压不同； 人体细胞最适：290mOsm/Kg； 鼠细胞最适：320mOsm/Kg； 大多数哺乳动物细胞，渗透压在260320mOsm/kg的范围都适宜。,2.3 温度,最适温度：3537； 39细胞代谢强度与温度成正比； 3940 中1h，即会受到

4、损伤，但仍能恢复； 4142中1h，细胞会受到严重损伤，但不至于全部死亡，部分仍可能恢复； 43时，细胞大多死亡。,2.3 温度,高于0时，低温只能抑制细胞代谢，并无伤害； 2535时，可缓慢生长； 4放置数小时，在置于37，细胞仍能继续良好生长； 冰点以下，溶质损伤、冰晶损伤，细胞死亡。,2.4 PH,每种细胞都有其最适的PH值； 大多数细胞适宜7.27.4，偏离这一范围对细胞不利； 细胞耐酸性比耐碱性强一些； 在偏酸性环境中更有利于细胞生长； 有些细胞也喜欢偏碱性环境，如成纤维细胞最适合PH7.47.6。,2.5 气相,5%CO2+95%空气； CO2既是细胞代谢产物，也是细胞所需成分；

5、CO2维持培养基的pH。 HCO3-+H+ H2CO3CO2+H2O,3 细胞培养基的概念,细胞培养基是人工模拟细胞在体内生长的营养环境，提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。 英文：Medium 粉剂倾向称为“培养基” 液体多称为“培养液”,4 培养基分类,天然培养基 合成培养基 无血清培养基,4.1 天然培养基,早期的细胞培养基; 直接源于动物组织提取液或体液，如血清、血浆凝块、淋巴液、胚胎浸出液等; 营养价值高; 成分复杂、差异大、不稳定、来源受限制; 血清使用最广泛。,4.1.1 血清的主要成分,血液=55%血浆+45%血细胞； 血清去除纤维蛋白（凝血因子）的血浆; 成分复杂，大部

6、分已知，少数未知; 血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等。,4.1.2 血清的主要作用,提供营养物质：氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等； 提供激素和各种生长因子： 胰岛素、肾上腺皮质激素（氢化可的松、地塞米松）、类固醇激素（雌二醇、睾酮、孕酮）等。 生长因子如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等 提供结合蛋白：结合蛋白作用是携带重要的低分子量物质，如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等，转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用。 提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤 对培养中的细胞起到某些保护作用： 有一些细胞，如内皮细胞、骨髓样

7、细胞可以释放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用，可终止胰酶的消化；血清蛋白形成了血清的粘度，可以保护细胞免受机械损伤；血清还含有一些微量元素和离子，他们在代谢解毒中起重要作用，如硒等。,4.1.3 血清的种类,牛血清使用最多 人血清 马血清 猪血清 羊血清 鸡血清 兔血清,4.1.4 牛血清,按照采血时间的早晚来分类的； 采血时间越早，营养物质越丰富，所含抗体也越少； 由于疯牛病的原因，到目前为止，我国政府仍然禁止从北美洲、欧洲和日本等地区进口牛血清，因此市面上的牛血清大多来自澳洲、南美洲，或是国产的。,4.1.5 牛血清的分类,胎牛血清(FBS): fetal bovine ser

8、um 直接胚胎心脏取血，胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。 新生牛血清(NBS):new born calf serum or new bovine serum 严格：出生24h内 宽泛：出生14d内 小牛血清（CS) ：calf serum 严格：出生10d30d 宽泛：出生1y内,4.1.5 牛血清存在的问题,4.1.6 血清的质量鉴定,外观：土黄色或棕黄色、透明清亮、无沉淀或极少沉淀、比较粘稠； 理化性质：如渗透压、pH值、蛋白电泳图谱、蛋白含量、激素水平、内毒素等； 血清中球蛋白主要是抗体，球蛋白含量越低血清质量越高； 血红蛋白也是越低越好。 微生物检测：

9、包括细菌、真菌、支原体、病毒等； 促生长效果：克隆形成率、贴瓶率测定法和连续传代培养法。,正 常,溶血,4.1.7 血清的贮存与使用,（1）贮存 长期冷冻（ -15）密封、避光； 短期4 、密封、避光，1m以内。,（2）解冻,28解冻过夜； 室温下全溶； 血清解冻的过程中不时摇匀（勿剧烈）； 尽量避免反复冻融和室温长时间放置； 用量不多时需分装冻存使用。,（3）血清的灭活,补体 (complement)：是存在于正常人和动物血清与组织液中的一组经活化后具有酶活性的蛋白质。 不耐热，可辅助和补充特异性抗体，介导免疫溶菌、溶血作用，故称为补体。 由30余种可溶性蛋白、膜结合性蛋白和补体受体组成的多

10、分子系统（补体系统） 细胞毒作用, 平滑肌细胞收缩, 肥大细胞和血小板释放组胺, 增强吞噬作用, 促进淋巴细胞和巨噬细胞发生化学趋化和活化。,56灭活30min，规则摇晃 除非必须，一般不需要灭活 灭活会造成血清沉淀物显著增多，血清的质量下降,（3）血清的灭活,（4）血清使用浓度,一般为5%20%，常用10%， 过多血清容易使培养中的细胞发生变化，特别是一些二倍体的无限细胞系，迅速生长之后容易发生恶性转化。,（5）血清中的沉淀,絮状物：主要是血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心3000rpm, 5 分钟去除，也可不用处理。 经过热处理过的血清

11、，沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物 在显微镜下观察象“小黑点”，常误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长。,4.2 合成培养基,用化学成分明确的试剂配制的培养基 组分稳定 需添加血清配合使用 由于细胞种类和培养条件不同，适宜的培养基也不同，主要包括：BME、MEM、DMEM、RPMI1640、HAM F12等。,4.2.1 BME ( Basal Medium Eagle),基础Eagle培养基（Basal Medium Eagle ），1955年由Eagle设计，是最简单的培养基，BSS12种氨基酸谷氨酰胺8种维生素，最先用于培养小鼠的L 细胞和人类HeLa细胞。 此基础上

12、改良的细胞培养基品种有MEM、DMEM、IMDM等。,是BME的升级版 仅含有12种必需氨基酸、谷氨酰胺和8种维生素 氨基酸浓度是BME的两倍 广泛适应各种已建成细胞系和不同地方的哺乳动物细胞类型的培养,4.2.2 EMEM or MEM(Eagles Minimum Essential Medium),是Dulbecco改进的MEM 氨基酸和维生素的浓度是BME的4倍 最先葡萄糖的浓度是1g/L，称为低糖DMEM 后来增加到4.5g/L，称为高糖DMEM 主要用于杂交瘤中骨髓瘤细胞和DNA转染的转化细胞的培养 高糖更适合高密度细胞培养，适用于附着稍差的肿瘤细胞、克隆培养.,4.2.3 DME

13、M (Dulbeccos Modification of Eagles Medium),McCoy等人在1959年研制 是一种专门为培养肉瘤细胞研制的培养基 适用于原代细胞、组织活检细胞和淋巴细胞培养， 还适用于较难培养的细胞，如皮肤，牙龈，睾丸，小鼠肾脏，大网膜，肾上腺，肺，脾，大鼠胚胎和其他组织的原代生长，以及活体组织的体外移植。,4.2.4 McCoy 5A,是McCoys 5A 的改进版 含有高浓度的肌醇 广泛用于悬浮细胞的培养，如人类白细胞，骨髓瘤细胞，杂交瘤细胞等血液来源的细胞。,4.2.5 RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute #

14、1640),是DMEM和F12按1:1比例配制而成； 神经生物学最常用的基础培养基； 可作为无血清培养基的基础液； 适用于血清含量较低条件下哺乳动物细胞培养。,4.2.6 DMEM/F12,是由 Iscove改良的Dulbecco培养基 较DMEM增加了几种非必需氨基酸、硒和一些维生素 最初用于培养红细胞和巨噬细胞前体 IMDM为营养非常丰富的培养液 非常适合于迅速增殖，高密度细胞的培养，包括Jurkat细胞，COS- 7，和巨噬细胞 IMDM支持小鼠B淋巴细胞，来自骨髓的造血组织，脂多糖刺激的B细胞，T淋巴细胞，和各种杂交细胞的生长 也可作为无血清培养的基础培养基,4.2.7 IMDM,19

15、50年由Morgan成功研制； 配方复杂，含有核苷酸，核酸等成分； 最初用于鸡胚肌细胞的培养； 还用于各种细胞的维持和病毒生产。,4.2.8 M 199 (Medium 199),含有附加的氨基酸、维生素以及核苷和脂肪酸 它可广泛应用于各种细胞类型 包括对营养成分要求苛刻的细胞。,4.2.9 MEM-Alpha,4.2.10 Hams F10 (Hams Nutrient Mixture F10) 由Ham发明，用于人类2倍体细胞和仓鼠细胞的培养。 4.2.11 Hams F12 (Hams Nutrient Mixture F12): F10 的升级版，含有更多的维生素、肌醇和氨基酸 是为在

16、低血清浓度下克隆CHO细胞而设计的 可以在加入很少血清的情况下应用 特别适合单细胞培养和克隆化培养 是无血清培养中常用的基础培养液 用于培养大鼠，兔子和鸡胚细胞，还用于中国仓鼠卵巢细胞以及肺细胞的培养,采用磷酸盐缓冲体系，氨基酸组成进一步改良，并由半乳糖替代了葡萄糖。 适用于快速增殖瘤细胞的培养 用于在CO2缺乏的情况下培养肿瘤细胞株,4.2.12 L-15 （Leibovitz Medium）,4.2.13 其他培养基,Fischers细胞培养基：用于白血病微粒细胞培养 Williams Medium E：用于大鼠肝上皮细胞的长期细胞培养。 MCDB 131 培养液：用于培养内皮细胞。 Op

17、ti-MEM I Reduced Serum Media：用于培养造血细胞。 植物血凝素（PHA）：增加细胞转化和DNA合成。,4.2.13 培养基的保存与运输,干粉：24个月，28避光保存，室温运输。 液体：12个月，28避光保存，不能冷冻，室温运输。,无血清培养基是加入成分明确的血清替代成分，既能满足细胞的培养要求,又能有效避免因使用血清带来的诸多不利因素。,4.3 无血清培养基,无血清培养基,4.3.1 无血清培养基发展历程,无血清培养基的发展大致经历了4代，即第一代一般意义上的无血清培养基，第二代无血清无动物衍生蛋白培养基，第三代双无培养基，以及正在研发中的第四代无血清培养基。,成分：

18、各种可替代血清功能的生物材料，含大量成分不明的 动植物蛋白。 优点：相对于含血清培养基，实验准确性、可重复性、稳定 性较高。 缺点：添加物化学成分不明确，不利于目标蛋白的分离纯化。 应用：人们根据自己需要对其成分进行一些改进，应用仍较 为广泛。,第一代：一般意义上的无血清培养基,第二代：无血清无动物衍生蛋白培养基,成分：完全不用动物来源蛋白，蛋白来源于重组蛋白或蛋白 水解物。 优点：降低了成本，太高了效率，加快了报批速度。 缺点：成分不是十分明确，实验及生产的稳定性不是很高。 应用：主要用于生物药品的研发和生产。,第三代：化学组分限定培养基双无培养基,成分：完全不含血清、无蛋白或含量极低，所含

19、蛋白是成分 已明。 优点：可以保持细胞培养与生产的恒定，目标蛋白分离纯化 更容易，成本大大降低，生产管理易控。 缺点：但对细胞特异性高，仅用于一种或几种细胞的培养。 应用：用于生命科学研究和基因工程药物开发,第四代：研发阶段,成分：无血清、无蛋白、成分十分明确。 优点：可高温消毒、适合不同细胞生长的全能培养基。 应用：广泛应用于生物和医学研究，以及工业上产。,4.3.2 无血清培养基的应用,疫苗、单克隆抗体和生物活性蛋白等生物制品的生产。 干细胞的体外培养和研究。 肿瘤的研究。 从多中细胞混杂的培养中选择目的细胞。 细胞体外分化的研究。 激素、生长因子和药物等与细胞相互作用的研究。 其他,4.

20、3.3 无血清培养基的组成及其主要补充因子,1、无血清培养基主要由两部分组成： A、基础培养基：DMEM、MEM、RPIM160、DMEM/F12等。 无血清的基础培养基一般为所需培养细胞相应的合成培养基，按需要可进行调整。 B、血清替代因子：在所有的补充因子中，胰岛素、转铁蛋白和硒几乎是所有细胞株在无血清培养基中生长都需要的。,2、主要补充因子,（1）激素和生长因子：多肽类和甾体类激素。 多肽类激素：胰岛素、生长因子、胰高血糖素等 甾体类激素：孕酮、氢化可的松、雌二醇等。 多肽类生长因子：表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子等。 （2）结合蛋白：转铁蛋白、血清白蛋白。 （3）贴壁和

21、铺展因子：纤黏蛋白、层粘蛋白、胶原、多聚赖氨酸、昆布氨酸、血清铺展因子等。 （4）微量元素：主要是硒。,（5）低相对分子量营养元素:维生素、脂类等。 维生素B、C、E等；丁二胺、亚油酸、-生育酚等。 （6）酶抑制剂：大豆胰酶抑制剂（常用）、牛胰蛋白酶抑制剂等。,4.4 高级培养基（Advanced medium）,浓缩了营养物质和其他成分的培养基 只需要2% 的血清(减少50-90%),4.5 专用培养基,一般为无血清培养基 如角质细胞、淋巴细胞、造血细胞、内皮细胞、肝细胞、神经元细胞、胚胎干细胞、CHO细胞、293细胞、各类昆虫细胞、杂交瘤细胞、羊水细胞等培养基。,查阅说明书、咨询供应商；

22、搜索ATCC或中科院细胞库； 查阅文献； 首选MEM做贴壁细胞培养、RPMI 1640做悬浮细胞培养； 在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。,5 如何选择培养基,5 如何选择培养基,GlutaMAX,L-丙氨酰-L-谷氨酰胺； 具有热稳定性； 在水溶液中更稳定，不会自发降解； 细胞可逐渐释放氨肽酶，水解二肽，缓慢释放L-谷氨酰胺和L-丙氨酸至培养基中，L-谷氨酰胺和L-丙氨酸可被细胞吸收利用。 时效长； 效果与添加L-谷氨酰胺相比略有延滞。,6 平衡盐溶液（BSS）,维持渗透压； 缓冲调节溶液的酸碱度； 供给细胞能量和无机离子； 主要包括PBS、DPBS、Hank

23、s、DHanks和Earle等。 常用的DPBS和 DHanks：配方中无钙镁离子，不会中和胰酶及EDTA活性，用于细胞解离前的清洗、配制试剂。 Hanks、DHanks：含酚红、葡萄糖。 PH：7.27.4,7 消化液,7.1 胰酶 使细胞间结合处蛋白降解，这时细胞由于自身内部细胞骨架的张力作用下成为球形，从而使细胞分开； 一般配制成0.1-0.25%浓度； 配制时要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡盐溶液； 胰蛋白酶在4就可能开始降解，如果在室温下放置超过30分钟，就会变得不稳定； PH8.0、37作用能力最强。,7.2 EDTA,破坏细胞间的连接； 常与胰酶配合使用； 使用浓度为0.0

24、2%。,7.3 胶原酶,分为、型以及肝细胞专用胶原酶； 作用温和； 不受Ca2+、Mg2+及血清的抑制； 常用剂量为最终浓度200U/ml（约为1mg/mL）或0.03%0.3%； ：用于上皮、肺，脂肪和肾上腺组织细胞的分离； ：适用于肝脏，骨，甲状腺，心脏和唾液腺组织； ：包含至少7种蛋白酶成分，能消化多种组织； ：包含至少7种蛋白酶成分，胰腺小岛组织的分离，将结缔组织分离成单个细胞。,7.4 中性蛋白酶,中性金属蛋白水解酶； 细胞能保持完整，细胞膜无损； 该酶非哺乳动物来源，不含支原体或动物病毒污染； 对于温度、pH的改变、以及血清成分都很稳定； 使用螯合剂或稀释就能简单灭活； 使用浓度0.6-2.4 U/ml。,8 抗生素,青链霉素（双抗） 青链霉素是广谱抑菌剂，对革兰氏阴性和阳性微生物有抗菌性； 青链霉素的有效浓度为100u/ml； 链霉素为100ug/ml； 母液：100 保存条件：-20冷冻保存，避免反复冻融,两性霉素B,作为一种抗真菌、抗酵母菌以及抗霉