抗菌肽及其在植物抗病基因工程中的应用

1、抗菌肽及其在植物抗病基因工程中的应用汪小福1，2，高智谋1，陈锦清2（1安徽农业大学植保学院，合肥；2浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所，杭州）1抗菌肽的分类广义的抗菌肽( antibacterial peptides) 是指广泛存在于生物体内对生物体具有抵御外界微生物的侵害, 清除体内突变细胞的一类小分子多肽，它们在动物的免疫细胞、空腔脏器粘膜、皮肤以及植物中都广泛存在。根据抗菌肽的来源不同可以将抗菌肽分为以下几类：1.1 防御素 是指吞噬细胞产生的一类具特征性片层结构和广谱抗微生物活性的小分子多肽。防御素广义上代表一大类具广谱抗微生物活性并有特征性蛋白质结构的小分子阳离子多肽(cati

2、onic peptides)，但通常是指脊椎动物吞噬细胞产生的防御素，或称髓系防御素(myeloiddefensins)。1.2 昆虫抗菌肽 根据其结构与功能可大致分为4类：天蚕素类（Cecropins），昆虫防御素（insect defensins），富含脯氨酸的抗菌肽(proline-rich peptides)和富含甘氨酸的抗菌肽(glycine-rich peptides)。（1）天蚕素类：天蚕素是最早发现的抗菌肽，它对革兰氏阳性菌和阴性菌都有较高的抗性。1980年Boman 等首次分离到纯的天蚕素A 和B。翌年，Boman又与Bennich等人合作测定了天蚕素A和B的一级结构，随后在

3、柞蚕肉蝇、烟草天蛾中都发现了天蚕素或类似天蚕素的抗菌肽。这些抗菌肽的分子结构相似：都有31-39个氨基酸残基组成；分子质量为4kDa左右；半胱氨酸(Cys)含量少，不能形成分子内二硫键；有强碱性的N端和疏水性强的C端；在肽的许多特定位置有较保守的残基，如2位具有色氨酸(Try)，5、8、9位具有1个或1对赖氨酸（Lys），11位具有天冬氨酸(Asn)，12位具有精氨酸(Arg)； 有些位置尽管残基不同，但仍是保守替换。1988年，Halak等人利用二维核磁共振技术测定天蚕素A的三级结构。N端1-4位4个氨基酸是非螺旋化的。天蚕素A的分子结构含有2段-螺旋。5-21位为第1个-螺旋，该螺旋中极性

4、与非极性氨基酸含量相当，因此，该螺旋对水和脂都具有亲和性，称为双亲的-螺旋。25-37位为第2个-螺旋，其中疏水氨基酸含量高，故该-螺旋疏水性强。22-24位形成一个Ala-Gly-Pro的结节部，这个结节部在其它细胞膜毒素(如 pardaxin、melittin、alamethicin)中普遍存在。可以推知，此种结构与天蚕素的抗菌活性密切相关。此外，所有昆虫的抗菌肽都酰胺化，天蚕素类也不例外，其C端的酰胺化，对其广谱性极其重要。（2）昆虫防御素：第1种昆虫防御素由Masturyama于1988年在一种双翅目昆虫肉(Sarcophaga peregrina)中发现。至今，昆虫纲中已有15大类3

5、0多种防御素被报道。发现有防御素的昆虫包括双翅目(5种)、鞘翅目（2种）、膜翅目（1种）、毛翅目（1种）、半翅目（1种）、蜻蜓目（1种）；但在鳞翅目昆虫尚未发现防御素。绝大多数昆虫防御素的分子质量为4kDa左右，由38-43个氨基酸残基组成。仅有1-2个例外：一种是肉蝇肽(sapecin_B)，由34个氨基酸残基组成；另一种是从膜翅目昆虫意大利蜂(Apis mellifera)中得到的royalisin，由51个氨基酸残基组成。昆虫防御素都有1个静电荷，且氨基酸序列中都含6个位置很保守的Cys， 能形成3个分子内二硫键。绿蝇防御素(phormia defensin)是研究得最清楚的防御素。该分

6、子由3个结构域组成：一个柔韧的N端环，一个亲水脂的-螺旋中心，一个带有拟转角反向平行的片层。不同种类昆虫的防御素分子结构具有很大的同源性，其主要差异在N端环的大小。而且Cys-X-X-X-Cys 或Cys-X-Cys(X代表任意氨基酸)结构普遍存在，使-螺旋通过分子内二硫键得以稳定。昆虫防御素可以抗革兰氏阴性菌，而对革兰氏阳性菌几乎无作用。与哺乳动物防御素不同，昆虫防御素对真菌及真核细胞不起作用。（3）富含脯氨酸的抗菌肽：这是20世纪80年代才发现的一类新型的昆虫抗菌肽。1989年Casteels等首先从膜翅目的意大利蜂(A.mellifera)发现：这类抗菌肽都由15-34个氨基酸残基组成，

7、其中，Pro质量分数在25以上，它们都带有正电荷，都含有Arg-Pro(R.P)或Lys-Pro(K.P)氨基酸对，有些带有典型的Arg-Pro-Arg(R.P.R)结构。但是这类抗菌肽除上述小分子肽类外，还包括一些分子量较大的肽，如双翅肽(diptericin)。在绿蝇、果蝇中都有双翅肽，都是由83个氨基酸残基组成的，一级结构相似，最大的特点是整个分子可分为2个明显的结构域。在N端是一个短的富含Pro的结构域，则称为P结构域(P domain)；而双翅肽分子的其余部分富含Gly，则称为G结构域(G domain)。富含Pro的抗菌肽可分为2类：一类是不具取代基的，如apidaecins 和m

8、etalnikawins等；另一类是O-糖基化的， 如drosocin和pyrrhocioricin，它们都带有1个N乙酰半乳糖-半乳糖与其中的苏氨酸(Thr)相连。众多研究表明，不含取代基的抗菌肽其活性明显偏低，如果把原来带有取代基的抗菌肽分子中的取代基去掉，则其活性会明显下降。（4）富含甘氨酸的抗菌肽：此类抗菌肽是近年来才发现的，分子质量为8-27ku，其共同特点是一级结构富含Gly。有些是全序中富含Gly，如鞘翅(coleoptericin)， 半翅肽(hemiptericin)；有些是某一结构域中富含Gly，如双翅目，肉蝇毒素(sarcotoxin )，凝集素(atacin)等，它们都

9、含有1个D结构域。该类抗菌肽Cys含量很少，或不含Cys，不能形成分子内二硫键，氨基酸残基上也不具有修饰基团。这类抗菌肽有2种分子量较大：一种是从天蚕中分离的凝集素，由188个氨基酸残基组成；另一种是从肉蝇中分离的肉蝇素，它们在N端都有1个P结构域，C端有1个G结构域。P、G两种结构域的存在可能分别对应两种不同的功能，因此，这几种肽的抗菌谱相对较广。1993 年，Casteels从意大利蜂的血淋巴中分离到一种富含Gly(质量分数为19)的抗菌肽，由93个氨基酸残基组成，对革兰氏阳性菌和阴性菌都有良好的抗性，而且对人和哺乳动物的许多病原菌都有抗性。（5）人工合成抗菌肽：另有一大类是人工合成抗菌肽

10、基因，如以cropin B为母本的SB-37，Shiva-1， MB39，ABP3，WHD，Shiva2A等。针对天然抗菌肽存在抗菌活性不够理想的缺点，还人工合成了由不同抗菌肽分子杂合而成的抗菌肽，如由cecropin A的N末端8个氨基酸残基和经改造的蜂毒素C末端组成的阳离子抗菌肽CEMA，cecropin A和蜂毒素杂合而成的15肽基因，以及由蛙皮素和蜂毒素杂合而成27肽等。另外抗菌肽还可以同其它类型的蛋白融合，产生具有双重活性的融合蛋白，这类具有双重活性的融合蛋白在医药上有巨大的商业应用价值。（6）其它来源抗菌肽：来源于人类、两栖类、植物类以及来源于人类胃肠道皮肤粘膜的抗菌肽，来自于附睾

11、的抗菌肽等。2 抗菌肽的结构特征与理化特性通常抗菌肽的一级结构具有如下典型特征：分子量小，约25 kDa左右，由1040多个氨基酸残基组成的肽链，多为线性肽，也可为环肽，多为半抗原；多数为碱性，其N端亲水，C端疏水。这一结构特征使抗菌肽具有表面活性剂活性；一些天然的抗菌肽的C端往往是酰胺化的，但也可为羧基；通过圆二色性分析、理论推测和脂质体模拟实验研究抗菌肽的二级结构特征，抗菌肽的-螺旋具有近乎完美的水脂两亲性，即圆柱形分子的纵轴一边为带正电荷的亲水区，而对称面为疏水区，此二级结构是决定抗菌肽破坏膜活性的基础；耐热，100，30min不被破坏抗菌活性；对原核生物细胞有很高的杀菌活性，而对真核细

12、胞无毒性。多数抗菌肽的等电点大于7，表现出较强的阳离子特征。抗菌肽对热稳定， 许多抗菌肽在100加热10 min 还能保持一定活力。抗菌肽对较大的离子强度和较低或较高的pH都有较强的抗性。另外，部分抗菌肽尚有抵抗丝氨酸蛋白酶、胰蛋白酶和(或)胃蛋白酶水解的能力。3 抗菌肽的作用机制3.1 抗菌作用机制抗菌肽的广谱杀菌作用，包括对革兰氏阴性菌和阳性菌，尤其对耐药菌株有明显的抑杀作用，对一些农作物和经济作物病原菌亦有作用，而且对如粗糙链雹霉、绿色木霉、大刀链孢等真菌有显著效果。关于抗菌肽的杀菌机制，国内外学者对此研究已很多，但至今仍存在认识分歧。Christensen等以脂双层为模型，详细描述了抗

13、菌肽作用于膜的过程。首先，抗菌肽通过静电作用被吸引到膜表面；然后，疏水尾巴插入细胞膜中的疏水区域，通过改变膜的构象，多个抗菌肽聚集在膜上形成离子通道，造成物质泄漏和细菌死亡。1996年，Lockey 在研究中利用电子显微镜和免疫胶体金技术观察到天蚕素A结合到大肠杆菌(Escherichia coli)膜上，形成一个9.6nm直径的病灶，形成直径4.2nm孔洞导致细胞内容物外泄和细菌死亡。Juvvadi通过对天蚕素A和蜂毒素(melittin)杂合体的抗菌肽研究，推测抗菌肽的抗菌作用的第一步是抗菌肽的阳离子与膜上磷脂基团的阴离子之间的相互作用；接着与膜上碳氢化合物的相互作用；然后肽分子的疏水基团

14、-螺旋插入膜上，聚合形成孔道，导致内容物外泄和细菌死亡。1997年，Silvestro研究发现，天蚕素A在低浓度下才会引起内容物的释放。所以，天蚕素A是通过改变膜离子梯度来杀死细菌的。目前，对抗菌肽抑杀真菌的作用机制研究较少。Cavallarin发现，位于天蚕素衍生物N末端-螺旋区域的11个氨基酸顺序，与其抗真菌活力有关。3.2 抗病毒作用机制Ourth和Renis曾报道，烟蚜夜蛾(Heliothis virescens)幼虫血淋巴对6种DNA、RNA病毒有明显的抑制作用，病毒感染力迅速降低，而且这种抗病毒具有广谱性。可喜的是，Wachinger于1998年研究发现，蜂毒素和天蚕素可以在亚毒性

15、浓度下抑制艾滋病毒HIV-1的基因表达，从而减少其增殖。对于细胞联合病毒的研究发现，蜂毒素可使Gag抗原和HIV-1 mRNA减少，蜂毒素和天蚕素可抑制HIV LTR(HIV long terminal repeat)的活性，这说明抗菌肽对艾滋病毒也有抑制作用。所以，抗菌肽的抗病毒潜能，是十分有意义的研究课题。3.3 抗寄生虫作用机制抗菌肽能有效地杀死引起人类及动物寄生虫病的寄生虫，如疟疾、chagas 氏疾、莱什曼病致病的寄生虫。现已有许多科学家做了进一步探讨。1998年，Diaz-Achirica等发现一种合成的天蚕素-蜂毒素杂合体对莱什曼原鞭毛虫有损伤作用，作用的目标是细胞质膜，它可以快

16、速降低细胞质膜的通透性，破坏膜电势，质膜形态也受到损伤。同年，Shahabuddin研究发现：抗菌肽对感染蚊子的疟原虫发育的不同时期有不同的作用，主要对卵囊期和子孢子期的疟原虫有明显的损伤。抗菌肽对卵囊期的疟原虫的损伤有时间依赖性，抗菌肽感染3d后，卵囊密度明显降低，内部形成大的空泡；而子孢子的膜通透性受破坏，形态受损，流动性降低，该抗菌肽对蚊子本身无毒性。 3.4 抗肿瘤细胞及癌实体瘤的作用机制抗菌肽能特异性地抑制某些肿瘤细胞生长，而对正常人体细胞却无害。因此，用其来开发抗癌药物前景看好，国内外已对抗菌肽杀伤肿瘤细胞的作用进行广泛研究，并取得可喜成果。南京师范大学生物系经多年研究，发现抗菌肽

17、体外培养癌细胞的作用主要是，使癌细胞膜上形成孔洞，内容物外泄，线粒体出现空泡化，嵴脱落，核膜界限模糊不清；有的核膜破损，核染色体DNA断裂，并抑制染色体DNA的合成。在荷瘤小鼠的抑制瘤的作用研究中，发现抗菌肽能显著抑制ECA腹水瘤荷瘤小鼠腹水的积累。此外，抗菌肽可调动机体的免疫机能，从体液免疫方面来抵抗癌瘤的侵入。实验观察到，注射抗菌肽，荷瘤小鼠脾指数进一步增高。4 应用前景构建各种抗菌肽转基因动植物的工程技术，目前国内外的抗菌肽基因工程正在蓬勃发展。鉴于抗菌肽具有分子量小、抗菌谱广等特点，人们借助基因工程技术，将其基因转入植物体内以改造品种，从而获得抗病植株。1991年，Destenfano

18、-Beltan 等将构建的Shival-1基因转入烟草，可延迟青枯病的发生，降低病情指数和植株死亡率。李丹青等用合成的天蚕素基因转入烟草、水稻、桑树中，也获得一定进展。抗菌肽转基因植物的研究为将来获得抗病植株提供了广阔的前景。同样原理获得的抗菌肽转基因动物可明显提高动物的抗病能力。用腺病毒为载体，将人LL-37 基因导入鼠体内后，转基因鼠血清和肺中LL-37 含量显著上升，对内毒素及大肠杆菌抵抗能力明显提高。1997年，DurvasuLa将天蚕素A转入长红猎蝽后，发现昆虫体内锥虫数量明显减少或消失。所有这些都说明抗菌肽抗菌、抗寄生虫的功能有很大的抗性育种的利用价值，可以通过抗菌肽的转基因工程构

19、建一个新品种来消除一些动植物的疾病。5 抗菌肽的开发应用难点目前对抗菌肽的研究也主要是停留在实验室阶段，很多应用前可能和用于临床和实践后可能遇到的问题都需要深入研究。在植物基因工程中主要问题是植物细胞对抗菌肽的降解。最早Alfefs等对转基因马铃薯进行Northern blot，49个株系中几乎都可检测到cecropiuB的mRNA，但检测不到抗菌肽蛋白质的存在，也没有观察到对Erwinia carotora的抗性。当以来自cecropinB的信号肽和cecropinA构建的表达载体转化烟草时，转基因烟草与对照相比，对烟草野火病假单孢菌的抗性并没有明显的增强。Hightower等虽然检测到了c

20、ecropinA，但其蛋白质表达水平很低，而且他们还观察到，加入叶片提取液中的人工合成的cropinA很快被降解,但若在加入抗菌肽前煮沸提取液，或者加入蛋白酶抑制剂，则不会被降解。有人认为转基因植株中表达的抗菌肽，可能是被植物胞间的蛋白质酶降解了，而且在马铃薯中之所以检测到抗菌肽，是由于马铃薯中有蛋白酶抑制剂I、11的缘故。不同抗菌肽对植物提取液的反应也不相同，当用来自不同植物的外周质提取物与cecropinB和MB39温育时，它们的半衰期从3min到25.5h不等。而以马铃薯外周质中的内肽酶与cecropinB和MB39分别温育，MB39的降解速度要慢的多，而两者的差别仅在第11位氨基酸的不

21、同。最近还在cecropinA的N端发现了三个黄曲霉（Aspergillus fiavus）的胞外蛋白酶作用位点，黄曲霉(Aspergillus flavus)是一种很有意义的病源微生物，因为未萌发的A.jlavus对抗菌肽不敏感，而萌发的A.jlavus对抗菌肽敏感。他们还观察到，除去这些蛋白酶后，并不能恢复cecropinA对A.jlavus的杀伤作用，推测是未萌发A.jlavus的细胞壁中缺乏麦角固醇造成的。植物细胞对抗菌肽的降解，是抗菌肽在转基因植物中不能大量积累的原因之一，而且不同的植物细胞对抗菌肽的降解作用不同。在临床医药上，首先是来源问题，天然提取工艺复杂，成本昂贵，并且资源有限；化学