基因分子生物学讲课书上缺少内容

1、 讲课部分内容（书上缺少的部分,缺图） 张俊武三、部分重要的病毒基因组（一） M13噬菌体 M13噬菌体是一种大肠杆菌丝状噬菌体，其基因组是含6400nt的单链闭环DNA。野生型M13噬菌体基因组，90%以上编码蛋白质，包含10个基因。多数基因间仅以数个核苷酸相隔，仅在基因VIII 和III以及基因II和 IV之间有较长的核苷酸相隔。这些基因间隔区含有调节基因表达和病毒DNA合成的元件。 M13噬菌体最大的优点是：在用做克隆载体时可产生仅含外源DNA某一条链的DNA分子。这种单链DNA分子可在以下工作中作为模板：1)双脱氧链终止法DNA测序2)制备仅有一条链得到放射性标记的DNA探针3)利用寡

2、核苷酸进行定点突变 （二） l噬菌体 l噬菌体是最早使用的克隆载体之一，常用做构建基因组文库和cDNA文库。 1l噬菌体的结构 l噬菌体基因组是长度约为50kb的双链DNA分子。在l噬菌体颗粒内，其DNA为线状双链分子，两条链的5端均有长12nt的互补单链（粘端，cos）。l噬菌体的基因组包含50个基因，其调控较为复杂，且多数基因都行使各自必不可少的生理功能。其中一部分（主要为噬菌体基因组中间部位）为可置换部位，常用来插入外源基因。左臂部分主要包含编码组装噬菌体头部和尾部所需蛋白的基因，右臂部分包含与DNA复制相关的基因，这两部分不能替换。 2l噬菌体的复制 l噬菌体线状DNA进入宿主细胞后，

3、粘端相对，并在宿主细胞连接酶作用下缝合切口，形成闭合DNA分子。该DNA分子在感染早期充当转录模板。在此期间，l噬菌体选择裂解或溶源两途径之一进行复制。（三）乙肝病毒（Hepatitis B Virus ,HBV） 1HBV基因组结构HBV的基因组结构奇特，是一环状的部分DNA双螺旋结构，长约3.2kb，其中2/3为双螺旋结构，1/3为单链。长链的5端与3端之间有300nt左右的缺口，与一种蛋白质形成共价连接。长链与短链的5端以250300nt互补。 长链为负链（与病毒mRNA互补），短链为正链，短链的长度视个亚型而异，约为长链的5090（长约1.62.8kb）。短链之间的空隙可由病毒颗粒中的

4、DNA聚合酶充填。HBV是目前已知的感染人类的最小的双链DNA病毒，但在很小的基因组中容纳了大量的遗传信息，因而HBV基因组结构显得特别精密浓缩，充分利用其遗传物质。重叠的基因顺序较多 HBV基因组中已确定的开放阅读框（ORF）有4个，分别编码病毒的核壳（C）蛋白、包膜（S）蛋白、病毒复制酶（聚合酶）及一种似乎与病毒基因组表达有关的蛋白质X。这些基因的顺序有些是重叠的。几年前新鉴别了ORF-5及ORF-6，均与X基因重叠，但功能尚不清楚。调节序列位于基因内部如与HBV基因组复制相关的顺序有：短链顺向重复顺序DR1和DR2及U5样顺序（因与反转录病毒末端的U5序列类似而得名）。DR1与U5位于前

5、C开放阅读框中，是合成DNA长链的起始部位。DR2位于聚合酶基因和X基因重叠处，是DNA短链合成的起始部位。与调节基因表达有关的顺序，如启动子，增强子，polyA添加信号，糖皮质激素受体结合敏感顺序（GRE），增强子结构，也都在编码蛋白质的基因顺序内。2.乙肝病毒的复制（四）反转录病毒 反转录病毒颗粒内的基因组由两条相同的单链正义 RNA组成，这使得反转录病毒为双倍体（这在病毒中是奇特的）。不同种类的反转录病毒RNA 结构相似，但长度有变化， 多在811kb 之间。和真核生物mRNA一样，反转录病毒RNA5端有帽子结构， 3端有poly(A)尾。基因组RNA的一部分与一个特异的宿主tRNA成碱

6、基配对，此tRNA起始DNA的合成，这也是反转录病毒的一个奇特之处。（五）腺病毒（adenoviruses） 人腺病毒DNA为双链线性DNA ，全长36kb，其突出的结构特点是分子末端存在反转重复顺序。腺病毒DNA的两条链分别称为L链（轻链）或r链（右链）和H链（重链）或l链（左链），每条链的5端都有蛋白与之结合。两条链可以分开并自己形成环状结构。二、质粒DNA 许多微生物（包括细菌，酵母，真菌等）细胞中含有染色体外的双链环状DNA分子，称为质粒（plasmid）。这些质粒都是独立于细菌染色体外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。然而，它们又依赖于宿主编码的酶和蛋白质进行复制和转录。在一般情况下，

7、质粒对宿主细胞生存并不是必须的，但质粒的某些基因，可以补充细菌基因的不足，有利于细菌的生存。如R质粒带有抗生素抗药基因，可使细菌耐受抗生素的作用；F质粒的变种F质粒可携带一些宿主的基因，如Leu基因，当共转化Leu-细菌时，可使该细菌在缺乏Leu的培养基中生长。由质粒产生的表型包括对抗生素的抗性，产生抗生素，降解复杂有机化合物，以及产生大肠杆菌素，肠毒素及限制酶与修饰酶等。（一）质粒的分类1.按复制机理，可分为两类： 严格控制型质粒（stringent plasmid） 这类质粒的复制受到宿主细胞的严格控制，在每个细胞中只含1或几个拷贝。松弛控制型质粒 （relaxed plasmid） 这类

8、质粒的复制不受宿主细胞的严格控制，每个细胞可含10200个基因，而且当宿主细胞蛋白质合成受抑时，如在培养基中加入氯霉素，质粒拷贝数可继续增加，甚至可增至10003000。2.按质粒的功能，质粒可分为三类： F质粒，即性质粒 F质粒长94.5kb的双链闭环DNA分子，包括三个功能区域：转移区，插入区，复制区。 F质粒可将宿主染色体基因转移到另一宿主细胞内。F质粒本身从F细胞转移到F宿主细胞后，可使后者变成F+细菌。 R质粒，即抗药性质粒 R质粒含抗药性基因，含有该质粒的细菌可产生对抗生素的抗药性。大多数R质粒由两部分DNA组成，一段称为抗性转移因子（Resistance transfer fac

9、tor, RTF）, 另一部分为抗性决定因子（R-determinant）。 Col质粒 该质粒含有大肠杆菌素(Colicin)的基因，可以杀死不含大肠杆菌素的亲缘细菌。另外，还有一些其它质粒，如Ent质粒，可以产生肠毒素，引起人类及动物的腹泻等。（二）质粒的一般性质1 绝大多数质粒都是环状超螺旋DNA分子，分子量范围很大，在106108道尔顿之间（1200kb以上）。酵母的杀伤质粒是一环状RNA分子。2 一个质粒所包含的基因都是单拷贝的。3 质粒可以转移 许多质粒可以从供体细胞把它的一个复本转移给受体细胞。例如E.coli的F质粒可以从F+细胞转移到F细胞，使后者变成F+,而前者也仍然保持F

10、+。F质粒还可以把一个细胞的部分DNA带到另一宿主菌中。4 质粒具有不同的复制能力 质粒DNA的复制要由负责复制细菌染色体DNA的多种酶群来完成，但是不同的质粒在宿主体内所使用的酶群不同，且在宿主中复制的程度也相差悬殊，因此，细菌细胞里所含质粒的拷贝数有高低之分。 一些质粒不能以高拷贝存在于宿主细胞，是因为这些质粒可以编码阻遏蛋白，抑制本身DNA的复制。质粒拷贝数增加时，阻遏蛋白浓度增加，质粒复制受到抑制，只有当宿主细胞分裂后，阻遏蛋白被稀释，质粒DNA方能再进行复制。对于一些低拷贝数的质粒而言，在细胞分裂期间，随着随机的分割事件的发生，质粒有可能从某些 细菌细胞中丢失。控制质粒拷贝数的基因出

11、现在包括DNA复制起点在内的一个质粒DNA区域内。5质粒的不相容性两种具有相同或顺序非常接近的复制子的质粒不能在子代细胞中稳定共存，当细胞分裂时会分别进入不同的子代细胞，这种现象称为质粒的不相容性（incompatibility）。当两种质粒的复制子相同或具有很高的同源性时，可产生同样的阻遏蛋白，彼此间有相互抑制作用，不能共存于同一细胞。具有不同复制子的不同群质粒可能共存于同一菌体细胞内。如F质粒和ColE1质粒可以共存。人类基因组计划简介n 人类基因组计划（Human Genome Project, HGP）是以揭示人类基因组3109 bpDNA序列并识别其中几万个基因为目标的计划。此计划于

12、1990年首先由美国科学家启动，计划历时15年，至2005年完成，但现在实际上已有世界多国科学家卷入。其内容可概括为完成四个图。1遗传作图 (genetic mapping) 遗传作图即应用遗传学技术构建能显示基因以及其他序列特征在基因组位置的图。. 遗传学技术包括系谱(pedigree)杂交育种实验，对人类则是检查家族史。最初使用基因作标记，现又增补了DNA多态性的遗传标记。 第一代DNA遗传标记是RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism, 限制性内切酶片段长度多态性)。 第二代DNA遗传标记是微卫星（microsatellet）或短串联重复

13、顺序(STR, Short Tandem Repeats 或 STRP, Short Tandem Repeat Polymorphism 或 SSLP, Simple Sequence Length Polymorphism)。法国与美国的几个中心合作，至1996年初，已建立了由6000多个STR为主体的遗传标记所组成的“连锁图”，平均分辨率（两个标记之间的平均距离）已达0.75cM。1996年，美国MIT的E.lander又提出“第三代DNA遗传标记”，即单个核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism, SNP）。2物理作图（physical mapping

14、） 是指应用分子生物学技术直接分析DNA分子，从而构建能显示包括基因在内的序列特征的位置图。 主要方法： 限制酶作图（restriction mapping）: 它在DNA分子上定位限制性内切酶识别位点的相对位置。 荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization, FISH）：将分子标记与完整染色体杂交来确定标记的位置。 序列标记位点（sequence tagged site, STS）: 通过对基因组片段进行PCR和（或）杂交分析，来对短序列进行定位作图。3 转录图 转录图，或称cDNA图，即在基因组上确定与全部mRNA相对应的DNA顺序位置。由分离到的cD

15、NA片段，即表达序列标签（EST, Expressed sequence tag）组成的“表达序列图”，就是人类“基因图”的雏形。4序列图 完成人类基因组3109的核苷酸序列图，也是最高层次的和最详尽的物理图，最人类基因组计划最终要实现的确定目标。人类基因组计划进展迅速，人类第22号染色体的全顺序于1999年底全部完成，第21号染色体液已于2000年5月基本完成（测定的序列已覆盖21号染色体的99.7%）。测序结果说明21号染色体含225个基因，22号染色体含545个基因。这两条染色体占整个人类基因组的2%，所含基因数共770个，据此估计人类基因组约有4万个基因，明显低于以前的估计（6万10万）。2000年6月26日，美国总统克林顿和美国两个进行基因组研究的主要研究组正式宣布已完成人类基因组的草图。2001年，HGP国际协作组和Celera公司分别将自己的人类基因组框架图发表在Nature(2月15日) 和Science（ 2月16日）。人类基因组的参考顺序（reference sequences）已于2003年4月完成，尚需进一步补充修改。2004年10月21日，国际人类基因组合作组（International Human Genomic Sequencing Consor