厦门大学生命科学学院复试经验

1、厦门大学生命科学学院复试经验(仅供参考)2012年理论复试题目一般是：1.简述细胞同步化答：在同种细胞组成的一个细胞群体中，不同细胞细胞可能处于不同的分裂时期，通过人工诱导的方法可以使整个细胞群体处于同一个分裂时期，我们称此为细胞周期同步化。细胞周期同步化方法：1、选择同步化 （1）有丝分裂选择法：M期细胞与培养皿的附着性低，振荡脱离器壁收集。优点：操作简单，同步化程度高，细胞不受药物伤害。缺点：获得的细胞数量较少（分裂细胞约占1%2%） 。（2）细胞沉降分离法： M期细胞体积大，可用离心分离。优点：可用于任何悬浮培养的细胞。缺点：同步化程度较低。2.诱导同步化 （1）DNA合成阻断法：选用D

2、NA合成的抑制剂，可逆地抑制DNA合成。常用TdR双阻断法：在细胞处于对数生长期的培养基中加入过量TdR（Hela 2mol/L；CHO 7.5mol/L）。S期细胞被抑制，停在G1/S交界处。移去TdR，释放时间大于TS时，再次加入过量TdR。优点：同步化程度高缺点：产生非均衡生长，个别细胞体积增大。（2）中期阻断法 用秋水仙素等细胞分裂抑制剂将细胞阻断在中期。优点是操作简单、效率高；缺点是可逆性较差。2、细胞培养的条件答：细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同：（1）无污染环境：培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的

3、防御能力，一旦被污染或自身 代谢物质积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。恒定的温度：维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标准温度为 36.50.5，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39时，细胞代谢与 温度成正比；人体细胞在39-401小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；在40-411小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢 复；41-421小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；当温度在43以上1小时，

4、细胞全部死亡。（2）气体环境：气体是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的 各种成分。 开放培养时一般把细胞置于 95%空气加5%二氧化碳混合气体环境中。 二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的PH值。大多数细胞的适宜PH为7.2-7.4，偏离这 一范围对细胞培养将产生有害的影响。但细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。有资料显示，原代羊水细胞培养PH6.8时最适。细胞培养液PH浓度的调节最常用的为加NaHCO3的方法，因为NaHCO3

5、可供CO2，但二氧易于逸出，故最适用于封闭培养，而羟乙基哌嗪乙硫磺酸 （HEPES）因其对细胞无毒性，也起缓冲作用，有防止PH迅速变动的特性而用于开放细胞培养技术中，其最大优点是在开放式培养或细胞观察时能维持较恒定 的PH值。（3）细胞培养基：培养基是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖增殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。培养基的种类很多，按其物质状态分为半固体培养基和液体培养基两类；按其来源分为合成培养基和天然培养基。 （ 1）合成培养基：如：1640等合成培养基是根据细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的。内含碳水化合物、氨基酸、脂类、无机盐、维生素、微量元素和细 胞生长因子

6、等。单独使用细胞虽有生存但不能很好的生长增殖。 （2）天然培养基：使用最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及其多活性物质。与合志培养基合用， 能使细胞顺利增殖生长。常见使用最为5-20%。3、western杂交答：原理：Western杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。其原理是：生物中含有一定量的目的蛋白。先从生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白，将蛋白质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中，经SDS-PAGE电泳将蛋白质按分子量大小分离，再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，接着将膜浸泡

7、在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭其非特异性位点。然后加入特异抗性体（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗（通常一抗用兔来源的抗体时，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗体），最后通过二抗上带标记化合物（一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）的特异性反应进行检测。根据检测结果，从而可得知被检生物（植物）细胞内目的蛋白的表达与否、表达量及分子量等情况。操作步骤：(1)用已制备好的SDS-PAGE分离的蛋白凝胶。(2)用一张滤纸，剪成与胶同样大小，在转移电泳缓冲液中预湿，放在Scotch-Brit Pad上，在胶的阴性端放上滤纸，胶的表面用该缓冲液浸湿，排出所有气泡

8、。(3)在胶的阳极面放置同样大小浸湿的硝酸纤维素膜，排出气泡，再在滤膜的阳极端放置一张滤纸，排出气泡，再放一个Scotch-Brit Pad。(4)将以上“三明治”样装置放入一个塑料支撑物中间，将支撑物放入电转移装置中，加入电转移缓冲液。(5)接通电源：使胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，电压为14V 4转移4小时或过夜。(6)将滤膜放入丽春红S溶液中5分钟，蛋白染色水中脱色2分钟，照像，用印度墨水将分子量标准染色，在水中完全脱色。(7)将滤膜放在塑料袋中，每3张加入5mL封闭缓冲液(1克速溶去脂奶粉溶于100ml PBS中)，封闭特异性抗体结合位点，室温1h，摇动，倒出封闭缓冲液。(8)在封闭

9、缓冲液中稀释第一抗体，加入后室温放置1小时，将滤膜转到塑料盒中，用200mL PBS洗四次，摇动。(9)在封闭缓冲液中稀释辣根过氧化物酶标记的二抗，重复步骤8。(10)将滤膜放在100mL新配制的DAB底物溶液中，大约23分钟就可显色，用水冲洗终止反应、照像。结果分析：分析阳性(显色)条带的分子量大小，而且根据信号(颜色)强弱分析蛋白表达量4、如何检测将一段基因导入到真核细胞并表达答：原位杂交技术：原位杂交技术（in situ hybridization）是 以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异核酸分子的技术。这一技术不需要从组织细胞中提取核酸，对组织中含量极低的靶序列有很高的灵敏度

10、，并可保 持组织与细胞的结构完整，反映特异核酸分子的定位。特别是配合使用能定位特异蛋白分子的免疫细胞化学技术，就能对生理或病理条件下从DNA到mRNA到蛋 白质这样一个基因表达过程进行定性和定位的分析，是基因表达研究强有力的手段。（一）原位杂交技术的原理 原位杂交技术的原理是：使含有特异序列、经过标记的核酸单链即探针，在适宜条件下与组织细胞中的互 补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。1、核酸分子杂交 DNA双链分子在一定条件下可以发生变性和复性的过程。分子杂交技术利用的就是两条互补的DNA单 链能够复性的性

11、质。分子杂交是碱基互补的两条异质核酸单链在一定条件下缔合形成双链分子的过程。这一过程相当于DNA的复性，只是核酸单链的来源不同。 原位杂交技术中，以经过标记的已知核酸分子为探针，以细胞内与探针序列互补的特异核酸分子为靶分 子，造成一定条件使探针与靶核酸分子在原位发生杂交，然后再对其探测。 2、探针标记 探针是经过标记的核酸分子，与待测DNA或RNA序列互补。探针主要有cDNA、RNA和寡核苷酸。 探针标记物有放射性的和非放射性的两类。常用的放射性标记物主要有35S、32P、33P 和3H。非放射性标记物主要有荧光素、生物素、地高辛和溴脱氧尿嘧啶等。通常标记物被导入某个单核苷酸而形成标记分子，如

12、四甲基罗达明-UTP、生物素-UTP、地高辛-dUTP等。然后通过各种酶促反应， 如随机引物法或PCR法，使标记分子参入探针。3、杂交 不同来源的序列互补的单链核酸分子在一定条件下借氢键相连而形成双链杂交分子的过程为杂交。杂交可 发生于RNA与DNA、DNA与DNA、RNA与RNA之间。形成的双链杂交分子为杂交体（hybrids）。4、杂交体的探测 对杂交体的探测根据探针标记物的不同而采用各种方法，目的是使标记的杂交体在光镜或电 镜下可见。 放射自显影 如果探针是同位素标记的，显示杂交反应的方法就是光镜或电镜水平的放射自显影技术。方法是在切片上涂覆核子乳胶膜后置于暗 盒中于4自显影一段时间，然

13、后经显影和定影后观察银离子在细胞和细胞器分布情况。 免疫细胞化学 对于非同位素标记的探针，可根据免疫细胞化学原理用直接法或间接法将探针标记物显 示出来。也就是采用那些在光镜或电镜下具有可见性的免疫细胞化学标记物来直接或间接地显示杂交探针标记物。如用地高辛标记探针杂交后，需加入碱性磷酸酶联结的抗地高辛抗体，再加入酶的底物来显示杂交体。（二）实验方法 原位杂交技术的实验方法主要包括：标记探针的准备，组织样品制备，杂交和杂交体探测。1.标记探针的准备 对cDNA、RNA和寡核苷酸三种探针的选择，要考虑所要检测的靶核酸分子的性质，如cDNA 和RNA 适宜于检测mRNA分子，寡核苷酸对mRNA的杂交效

14、率和特异性都不如RNA探针。 2.组织样品制备 光镜原位杂交标本的固定多使用4%多聚甲醛，常规 石蜡包埋和切片，但在操作过程中应提防RNA酶污染。电镜原位杂交标本的固定也采用4%多聚甲醛。与免疫细胞化学技术一样，电镜水平的原位杂交可以在未经 包埋的组织切片上进行，称包埋前技术；也可以在超薄切片上进行，称包埋后技术。冷冻切片能较好的保存靶核酸因而较易获得杂交信号，但对细胞结构的保存较 差。3.杂交 杂交是在一定温度和离子强度条件下让标记探针与组织中靶分子结合的过程。杂交的效率和特异性是优化杂交条件的出发点，也是需要兼顾的两个方面。影响因素主要是探针的结构、杂交温度、杂交液中的甲酰胺浓度和 离子强

15、度、杂交后漂洗等。要通过实验对条件进行优化。4.杂交体探测 根据探针标记物的不同采用放射自显影方法或免疫细胞化学方法显示杂交结果。5、如何检测两个蛋白质是否相互作用。答：目前研究蛋白质与蛋白质之间相互作用的方法有（1）荧光共振能量转移技术（2）噬菌体展示技术（3）酵母双杂交系统等。常用的研究蛋白质相互作用的方法有：串联亲和纯化(tandemaffinitY PU rific atiOn)、免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)、酵母双杂交(yeast two hybrid)、噬菌体展示(phage display)和化学交联(chemical crosslinking)等(

16、生命的化学2008年28卷4期)现以荧光共振能量转移技术为例加以说明：传统的蛋白质-蛋白质间相互作用的研究方法都要破碎细胞或对细胞造成损伤，无法做到在活细胞生理条件下实时的对细胞内蛋白质-蛋白质间相互作用进行动态研究 。荧光共振能量转移技术技术的应用结合基因工程等技术正好弥补了这一缺陷，该技术可用于研究活细胞生理条件下研究蛋白质-蛋白质间相互作用以GFP的两个突变体CFP、YFP为例简要说明其原理： CFP的发射光谱与YFP的吸收光谱有相当的重叠，当它们足够接近时(10nm范围内)，用CFP的吸光激发，其发色基团将会把能量高效率地共振转移至YFP的发色基团上，所以CFP的发射荧光将减弱或消失，

17、此时可以通过测定CFP荧光强度的损失量来确定这两个蛋白质之间是否相互作用。两个蛋白距离越近，CFP所发出的荧光被YFP接受的量越多，检测器接收到的荧光就越少。从而反映这蛋白是否直接相互作用及作用强弱。两个发色基团之间的能量转换效率与它们之间的空间距离的6次方成反比，对空间位置的改变非常灵敏。实验技能提取质粒：原理：质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上 携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。从宿主细

18、胞中提取质粒DNA，是DNA重组技术中最基础的实验技能。分离质粒DNA有三个步骤：培养细菌使质粒扩增，收集和裂解细菌，分离和纯化质粒DNA。在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂。所以，多数质粒粗提取物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状 DNA（cccDNA）： 质粒的两条链没有断裂；超螺旋开环DNA（ocDNA）： 质粒的一条链断裂；松弛的环状分子线形DNA（lDNA）： 质粒的两条链均断裂；线性分子质粒DNA的分子构型 。质粒DNA琼脂塘凝胶电泳模式图可分为：松弛线性的DNA； 松弛开环的OC构型； 超螺旋的SC构型。由于琼脂糖中加有嵌入型染料溴化乙

19、锭，因此，在紫外线照射下DNA电泳带成橘黄色。 道中的SC DNA走在最前沿，OC DNA则位于凝胶的最后边；道中的L DNA 是经核酸内切限制酶切割质粒之后产生的，它在凝胶中的位置介于OC DNA 和 SC DNA 之间。碱裂解法提取质粒DNA实验原理和操作步骤实验原理 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐

20、缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。（简明原理：碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。）细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条

21、件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。一、材料含pUC19质粒的大肠杆菌，1.5ml塑料离心管, 离心管架，枪头及盒、卫生纸。二、设备微量移液器(20l,200l,1000l)， 台式高速离心机，恒温振荡摇床， 高压蒸汽消毒器(灭菌锅)， 涡旋振荡器，恒温水浴锅，双蒸水器，冰箱，等。易生物仪器库：/yp/product-list-42.html易生物试剂

22、库：/yp/product-list-43.html三、试剂准备1、 LB液体培养基：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5g，NaCl 10g，溶于800ml蒸馏水中，用NaOH调pH至7.5，加水至总体积1升，高压下蒸气灭菌15分钟。2. 氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 100mg/ml水溶液，-20保存备用。3. 溶液：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。配制方法：1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml，0.5

23、M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在121高压灭菌15min ，贮存于4。4. 溶液：0.2M NaOH，1% SDS。配制方法：2M NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。5. 溶液：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。配制方法：5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4保存备用。6. 苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。7. 无水乙醇；8.

24、 70%乙醇；9. TE：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)。配制方法：1M Tris-HCl（pH 8.0）1ml，0.5M EDTA（pH 8.0）0.2ml，加ddH2O至100ml。121高压湿热灭菌20min，4保存备用。1M Tris Cl（Tris(三羟甲基)氨基甲烷）：800ml H2O中溶解 121g Tris碱，用浓盐酸调pH值，混匀后加水到1L；0.5M EDTA（乙二胺四乙酸）：700ml H2O中溶解186.1g Na2EDTA.2H2O，用10M NaOH调 pH8.0(需约50ml)， 补H2O到 1L。10. RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/L TrisCl(pH7.5), 15mmol/L NaCl中，配成10mg/ml的溶液，于100加热15分钟，使混有的DNA酶失活。冷却后用1.5ml eppendorf管分装成小份保存于-20。四、操作步骤1.