分子生物学-10-2-第五章-2 电泳 RT

1、5.2.1 电泳 电泳法 自由电泳（无支持体） 区带电泳（有支持体） 自由电泳 ：Tise-leas式微量电泳、显微电泳、等电聚焦电泳、等速电泳及密度梯度电泳 电泳仪构造复杂、体积庞大，操作要求严格，价格昂贵 区带电泳：琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖凝胶电泳技术1、特点天然琼脂（agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（agarose，约占80%）及琼脂胶（agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷，而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效

2、果。因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下2、优点1. 操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可以进行电泳 2. 凝胶结构均匀，含水量大（约占98%99%），近似自由电泳，样品扩散较自由电流，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好 3. 琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯检测及定量测定 4. 电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长期保存 3、用途 1. 常用于分离、鉴定核酸，如DNA鉴定，2. DNA限制性内切核酸酶图谱制作、质粒分离等是识别DNA的特异序列并在识别位点或者周围切割双链DNA的一类内切酶4、原理 琼脂糖凝胶

3、电泳对核酸的分离作用主要是依据它们的相对分子量质量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。 1、核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系 （1）DNA分子的大小在凝胶中，DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值 （2）琼脂脂糖的浓度如下表所示，不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。 影响琼脂糖电泳迁移的主要因素 DNA的大小 D

4、NA的构象* 琼脂糖浓度* 缓冲液* 不同构像质粒 2、核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 （1）不同构型DNA的移动速度次序为：共价闭环DNA（covalently closed circular，cccDNA）直线DNA开环的双链环状DNA。 （2）当琼脂糖浓度太高时，环状DNA（一般为球形）不能进入胶中，相对迁移率为0（Rm=0），而同等大小的直线双链DNA（刚性棒状）则可以长轴方向前进（Rm0）， （3）这三种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，但同时，也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。5、电泳方法1. 凝胶类型垂直型及水平型（平板型）。水平型电泳时，凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下

5、1-2mm，故又称为潜水式。制胶和加样比较方便，电泳槽简单，易于制作2. 缓冲液系统EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸（TEA），缓冲能力较低Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE）等，有足够高的缓冲能力浓度约为50mmol/L（pH7.57.8）。3. 凝胶的制备以稀释的电极缓冲液为溶剂，用沸水浴或微波炉配制4. 样品配制与加样DNA样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解缓冲液内含有0.25%溴酚蓝或其他指示染料，含有10%-15%蔗糖或5%10%甘油，以增加其比重，使样品集中。为避免蔗糖或甘油可能使电泳结果产生U形条带，可改用2.5%Ficoll（聚蔗糖）代替蔗糖或甘油 5.

6、 电泳琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果表明，在低浓度、低电压下，分离效果较好。在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。在电场强度增加时，较大的DNA片段迁移率的增加相对较小。因此随着电压的增高，电泳分辨率反而下降为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不宜高于5V/cm。6. 染色和拍照常用荧光染料溴乙锭（EB）染色脉冲电场凝胶电泳（PFGE）1. 1984年，D.R.Cantor发明的。分离超大分子量的DNA分子。2. 在脉冲电泳中，电场方向是周期变化的，头一个脉冲电场方向与核酸的移动方向成45 角，下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45

7、角，由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着，这就使得DNA分子必须随时调整其泳动的方向，来适应凝胶孔隙的无规则变化。 3. 与分子量小的DNA分子相比，分子量大的DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位，使之能够按新的方向游动，所以迁移率就慢，4. 分离大分子量DNA, 107bp的DNA大分子。5.2.2 细菌转化 筛选 转化：细菌吸收外源DNA而导致性状发生遗传改变。 感受态：细菌处于容易吸收外源DNA的状态细菌产生感受态的类型 在生长周期的任何时刻自动产生感受态；（e.g. 枯草杆菌） 在生长周期的特定时刻产生感受态；（e.g .大肠杆菌）制备感受态

8、细胞方法 原生质体法 电击法 特殊试剂诱导法：CaCl2诱导法CaCl2诱导转化 0,CaCl2低渗溶液中,细胞膨胀成球, 外源DNA形成抗DNA酶的羟基钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面, 短时间42热击处理,促进细胞吸收DNA复合物。 将细菌放在非选择性培养基上保温一段时间，使抗氨苄青霉素的表型表达后，再转到含氨苄青霉素的选择性培养基上，长出来的菌即为转入了外源基因的菌株。重组DNA转化的受体细胞常见的宿主细胞：DH5a: 缺陷型的菌株，可与pUC编码的b-半乳糖苷酶氨基端实现a互补。HB101: 用于大规模制备质粒的抑制型菌株，转化效率高JM101: 可支持带有琥珀突变载体生长的宿主菌JM10

9、9: 支持带有琥珀突变载体生长的重组缺陷的抑制型菌MZ-1: 温度敏感的溶源性菌株，用于含有噬菌体启动子质粒载体的宿主菌筛选(1)抗药性筛选（插入失活筛选法）:利用载体上的抗药性选择标记进行筛选。通过在抗药性标记上插入外源片段引起的基因失活，在相应选择性培养基上进行抗药性培养。为了进一步筛选出重组子，可利用质粒载体的双抗药性进行再次筛选。(2)蓝白斑筛选：显色反应选择法(-互补法) 将含有-半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和氨基端（N端）146个氨基酸编码序列的质粒转化至可编码-半乳糖苷酶羧基端（C端）部分序列的宿主细胞中，可使各自无活性的片段实现互补，融为一体，产生具有酶学活性的蛋白，从而使转化的宿主菌在含有IPTG/X