分子医学技能：实验六 凝胶过滤层析法分离生物大分子

1、实验六 凝胶过滤层析法 分离生物大分子,层析也称之色谱，基本原理是分析样品作为流动相流过固相时，由于样品中的各个成分与固相相互作用不同使得样品中的各个成分通过固相的速率产生了差别，从而达到分离样品中各个成分的目的。 层析因固相介质不同又分为: 离子交换层析 分子筛层析 吸附层析,层析原理,凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤、分子筛层析或排阻层析。 单个凝胶珠本身象“筛子”。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。,凝胶过滤层析,带网孔的葡聚糖珠,小分子进入葡聚糖珠内,大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出,凝胶过滤层析过程示意图,层析法分离生物大分子的一般步骤： 将作为固相成分的

2、不溶性基质，例如葡聚糖凝胶、纤维素、树脂等填充到柱子中，用平衡液平衡。 然后加样品，再用适当的溶剂洗脱。 样品中各种成分通过柱子取决于与固相成分的相互作用，最后以不同速率被洗脱出来，达到将各个成分分离的目的。,本实验的固相载体是葡聚糖凝胶G-50，它适用于分子量范围在1500-20000 Da之间的多肽与蛋白质的分离。,被分离的样品有： 蓝色葡聚糖2000，分子量为200万Da 血红蛋白A，分子量为17000万Da 2,4-二甲基苯酚（DNP）-天门冬氨酸，分子量500Da,被分离的样品有： 蓝色葡聚糖2000，分子量为200万Da，蓝色 血红蛋白A，分子量为1.7万Da，红色 2,4-二甲基

3、苯酚（DNP）-天门冬氨酸，分子量500Da，黄色,实验试剂: 玻璃层析柱 125cm 交联葡聚糖 G-50 (Sephadex G-50) 洗脱液,1）预装层析柱(示教,注意：不要干柱) 2）柱的平衡 洗脱缓冲液持续低速过柱，直至凝胶均匀压缩，约20cm高（不要干柱）。 3）上样 控制液面，使其恰好平床表面，关闭出口，用吸管小心把样品沿管壁加入，打开出口，让样品液面降低至床表面（不要干柱） 。,实验操作,4）洗脱与收集 先加少量洗脱液洗下管壁样品，进入层析柱，然后加入洗脱液洗脱，进行洗脱的同时开始收集样品，每管收集20滴。,层析法的相关概念,层析法:（色谱法）是指利用待分离的样品中各组分的理

4、化性质（吸附力、分配系数、电荷、分子量、亲和力等）的差异，使其在流动相的作用下通过固定相时的移动速度不同，从而达到相互分离的目的。,固定相：固定不移动的一相，一般是指支持物中所含的水分。阻止所分离的样品向前移动（阻力） 流动相： 洗脱时所用的溶剂，也叫洗脱液。不断地前移，并带动所分离的样品向前移动（动力）,洗 脱：用洗脱液冲洗曾析柱，使样品中不同组分得以分离的过程。 洗脱曲线：以洗脱的体积为横坐标，组分的浓度为纵坐标作图所得的曲线。,层析法分类,1.根据分离原理： 吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析。 2.根据流动相不同： 液相层析（液-液层析，液-固层析）、气相层析（气-液

5、层析，气-固层析） 3.根据固定项（支持物）的装填方式： 柱层析、薄层层析、纸层析、薄膜层析,紫外吸收测定蛋白质含量,利用经验公式直接计算样本蛋白质含量 （P130）,【原理及说明】,蛋白质中的酪氨酸和色氨酸含有共轭双键吸收高峰在280nm处。在此波长范围内，蛋白质含量与吸光值成正比。 操作简便、样品溶液可回收，同时可估计蛋白质含量。 OD值应在0.05-1.0之间。 公式计算时也应注意各种蛋白质和各种核酸在280nm及260nm处的光吸收值也不尽相同，不同蛋白质中的酪氨酸和色氨酸含量有差异，故计算结果有一定误差。如果设定标准管，则应与测定管的蛋白质氨基酸组成应相似，以减小误差。,器材 UV-722型紫外分光光度计 试剂 (一)蒸馏水 (二)清蛋白(人或牛)纯晶 (三)待测样本蛋白质,操作步骤,适当稀释蛋白质样本（根据实际情况），在280nm和260nm两处波长分别测得光密度值、再按下列公式计算。 1、OD2800D2601.5时，用Lowry-Kalokar公式： 样本蛋白质含量(mgml) =1.5OD2800.75OD260 2、OD280OD2601.5时，用Lamber-Beer定律计算： 样本蛋白质含量(mgml) =OD280（KL