生物技术制药：抗体工程制药（3）

1、第四节 噬菌体抗体工程,一、噬菌体展示技术基本原理 抗体库技术 抗体库在原核系统功能性表达多样性抗体基因(repertoire) 通过多种选择手段筛选出特定性能的抗体基因,抗体库技术产生的三项技术基础,RT-PCR：能够克隆全套抗体可变区基因 噬菌体展示技术（phage display) 抗体基因片段在大肠杆菌的功能性表达,一、基本原理,模拟体内B细胞产生抗体的过程 可绕过免疫直接制备全人源性抗体,接头DNA,VH VL,噬菌体表面呈现的小分子抗体,基因III或基因VIII,外壳蛋白,VH,VL,抗体库的构建,抗体库的富集筛选,二、噬菌体抗体库,（一）噬菌体抗体库种类 1.天然抗体库：来源于未

2、经免疫的供体。代表天然抗体在供体内的抗体谱，亲和力低 2.免疫抗体库：来源于经免疫的供体。亲和力高，多样性低 3.半合成抗体库：CDR1和CDR2来自人胚系，CDR3随机合成。库容大，亲和力低。 4.合成抗体库：VH和VL基因合成,VH Pool,VL Pool,scFv Pool,105 DNA Sequences,105 DNA Sequences,Randomly Ligate Combinatorial,（二）噬菌体抗体库的表达载体 1.lamda噬菌体 2.丝状噬菌体 3.噬菌粒,一、 抗体库技术 1.获取目的基因：RT-PCR 2.抗体库技术的载体：噬菌粒（phagemid）载体

3、3.淘筛（panning）：用固相化抗原对表达产物的载体进行淘筛，淘汰非目的克隆，使目的克隆大量扩增。 4.表达与鉴定：目的克隆经过鉴定后，再导入感受态菌株，进行可溶性表达，其产物用Western blot分析确定后，就完成了全过程。,（三）噬菌体抗体库的构建方法,Phage Display of Fab To Optimize Antibodies,Gene III,CH1,VH,CL,VL,VL,VH,Gene III,Expression Plasmid - “Phagemid”,Escherichia coli,Peptide Display,New England Biolabs P

4、hD System,E. coli,109 different 7-mer peptides Ca. 100 copies each/assay,设计VH/VL或L链/Fd链基因上、下游引物进行RT-PCR 将PCR产物VH/VL或L链/Fd链重组到粘粒或杆状噬菌体载体中建立文库 近年来PCR技术的发展简化了获取可变区基因的过程，用5端前导顺序或框架区引物及3端恒定区域V基因中的J区引物，可以从很少量的细胞中扩增得到可变区片段，PCR产物能直接克隆到表达载体上。通常针对不同的VH和VL家族采用不同的引物。,f1 ori,Amp,r,Phage-displayed Peptide Library

5、,Selection From Library of Random Mutants,Random Library of DNA Sequences,Gene 3 or 8,+,Gene 3 Fusions,Each Phage Displays One Peptide Sequence,Translated from DNA to Peptide in E. coli,筛选,（1）表位筛选 纯抗原筛选 全细胞或裂解液进行筛选 （2）功能性筛选：生物学功能，如抗体酶 （3）选择性感染筛选：噬菌体感染能力的恢复,1.固相或液相纯抗原的筛选、 2.全细胞筛选、 3.切片组织筛选,E. coli,Se

6、quence Fusion DNA,Replicate Amplify,“Winners”,Infect,Purify,噬菌体表面展示文库技术的要点:,外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N端,将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因g3或g8的先导系列的紧靠下游,随机克隆入相应载体形成组合文库,从免疫或未被免疫的B细胞中PCR扩增抗体全套基因片段,用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增”数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。,使翻译出的抗体分泌到细菌的质周腔内，形成游离的抗体片段，经过纯化即可获得目的抗体。,筛选到的噬菌体再将基因g3或g8切除后，

7、转入大肠杆菌，,三、噬菌体抗体库技术的特点及应用,1、建立具有相当容量的抗体库：组合库 2、避开了人工免疫和杂交瘤技术：抗体库的大容量和极高的筛选效率，可以调出任意抗体基因，用基因工程方法制备抗体，因而能避免使用人工免疫动物和细胞融合技术。 3、适合工业化生产：用细菌操作 4、模拟天然全套抗体库：1011库容，包含B细胞全部克隆。来自人体外周血、骨髓或脾脏的淋巴细胞提取的mRNA反转录的cDNA扩增，是人体多克隆细胞的总mRNA。使用的通用引物采自多个人体，具有人的种属普遍性。抗体的VH和VL基因的随机重组也增加了抗体的多样性。,5、抗体表型与基因型一致 6、筛选后得到的人源化可变区抗体，无异

8、种蛋白反应 可获得高亲和力的人源化抗体：在噬菌体抗体库中，VH和VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程，所用的抗体基因又来自人体，因此，所产生的抗体必然都是高亲和力的人源化抗体。,宿主细胞: 杂交瘤 细菌 筛选范围 : 103 107109 时间: 几个月 几周 操作: 繁杂 相对简单 免疫: 必须 可避免 人源抗体: + 费用: 高 低 生产量: 有限 无限 基因获取: 再克隆 直接 应用前景: 有限 不可估,抗体库介绍,英国剑桥抗体技术公司（Cambridge Antibody Technology, CAT），现被英国MedImmune公司收购。CAT是噬菌体展示技术领域的领先

9、者，其抗体基因来源于健康人的血液细胞，已经建立了库容为1011噬菌体文库。通过结合全自动装置和基因组技术，进行高通量分离和筛选。CAT还建立了自动化的培养基通量克隆、转染和纯化系统，用于将ScFv转变成完整的IgG。CAT上市产品有抗TNF-的阿达木单抗（Adalimumab，HUMIRA）；处于期临床试验的抗IL-12和IL-23的Briakinumab（ABT-874.）；,美国Dyax公司建立了的半合成Fab噬菌体抗体库，库容为3.51010。该抗体库的重链CDR1和CDR2序列为合成引物克隆的，重链CDR3序列和轻链基因来源于人的B细胞。该抗体库目前处于临床试验期的产品有抗VEGFR2

10、的Ramucirumab (IMC-1121B)和抗EGFR的MC-11F8*； 德国MorphoSys AG公司建立了一个人组合抗体库(Human Combinatorial Antibody Library，HuCAL)。HuCAL的基因都是通过合成得到的，该公司已经建立了库容为1.61010的Fab噬菌体抗体展示文库。：抗A40/42的Gantenerumab等,噬菌体展示技术的应用现状,抗体： 抗狂犬病毒的单链抗体，抗HIV-1囊膜糖蛋白的单链抗体，此抗体可专一性杀死被HIV-1感染并表达有gp120的淋巴细胞, 中和响尾蛇毒素的单链抗体，等等。 2.疫苗： 展示在噬菌体表面的HIV-

11、1 的gp120-V3 环 可象天然抗原一样引起显著的免疫应答, 等等,3. 多肽类药物： 如一些激动剂或拮抗剂从多肽库中分离鉴定出来；已获得一13 肽，它能中和蛇毒 -bungarotoxin；从CX7C 多肽库中掏选到一个多肽能与 Hantavirus 结合，并使该病毒不能结合或感染细胞。人血管促生素（angiogenin）是一种能促进肿瘤血管生长的蛋白，用这个蛋白去淘选一个噬菌体展示多肽库，所获得的一个环状8肽能与血管促生素结合，并能阻遏血管促生素的活性等等。,4.肿瘤药物导航载体： 用肿瘤细胞特殊的受体蛋白从展示文库中淘选到的多肽或单链抗体，可以作为抗癌药物的定向输送工具 。一个成功的

12、实例是：将噬菌体多肽展示库注射入具有肿瘤的小鼠体内，然后杀死小鼠，取出肿瘤，再将结合其上的噬菌体洗脱下来。展示在其上的多肽具有与该肿瘤的特异性亲和力。将此多肽与细胞毒素 doxorubicin 偶联。结果显示，此偶联物具有更强的抑制肿瘤的效果.,已上市的有阿达木单抗Humira (adalimumab, D2E7)，第一个全人单抗（2002） 从事全人源抗体开发的英国剑桥抗体技术公司(CAT)和Abbott Laboratories公司采用的噬菌体展示技术，筛选的抗TNF-（D2E7）全人抗体。Humira用于治疗类风湿性关节炎,目前噬菌体抗体库技术也存在不足之处 如从未经免疫动物的抗体库获得

13、的抗体亲和力不高、受外源基因转化率的限制、抗体库的库容不足以涵盖一些动物的抗体多样性等 因此，大容量抗体库是获得高亲和力抗体和针对稀有抗原抗体的关键,第五节转基因动物表达抗体,（一）分泌完全人源化抗体转基因鼠的建立 噬菌体抗体库技术得到的是小分子人源化抗体，不能得到完整抗体 1994年美国Cell Genesys公司和Genpharm国际公司同时得到转人抗体基因小鼠 (human antibody mouse，HuMab),将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生大量完全人源化抗体（1997年） Xenomouse（Abgenix）含1020 kb人Ig重

14、链和800 kb的人Ig轻链基因的基因敲除小鼠。 Xenomouse含大多数人重链(66/95 VH)和K轻链(32/76 VL)可变基因、全部D区和JH区、人重链和K(CK)恒定区及已知与Ig有关的多数调控元件,Xenomouse建立了较强的体液免疫功能。能诱导类似于人类的多样性初次免疫应答。用人抗原再次免疫Xenomouse可发生强烈的二次免疫应答，产生高亲和性的人Ig单抗,XenoMouse Technology:Over 6 Years of Proven Success,Mouse Ab Genes Inactivated,XenoMouse Mice,Human Ab Genes

15、Introduced,凯龙公司（Chiron），Genentech、辉瑞公司（Pfizer）安进公司Amgen得到Abgenix 公司的XenoMouse授权的专利技术 目前，用XenoMouse小鼠产生的人单抗有抗EGFR、IL-8、TNF-a、IL-6、L-selectin和CD147等 Abgenix公司采用XenoMouse得到的针对EGFR的人抗体(panitumumab，ABX-EGF) 已经上市,帕尼单抗(Panitumumab) :靶向表皮生长因子受体(EGFR)的全人源化单克隆抗体,治疗结肠直肠癌 2006/09 包装规格: 400毫克/20毫升/瓶 销售单价(US): 4,

16、724美元 销售单价(RMB): 32,120 元,PANITUMUMAB,XenoMouse generates fully human antibodies Panitumumab is a fully human IgG2 directed against EGFr High Affinity,1.微基因重组子技术:把人Ig基因组中间断存在的基因片段连接在一起，分别组建成轻重链微基因，将微基因质粒注入小鼠胚胎原核中，获得转基因鼠。与内源性重链，轻链缺失的鼠杂交，获得双转移基因，双链缺失的纯和鼠，免疫该鼠后，取脾细胞与人骨髓瘤细胞杂交，获分泌人抗体的杂交瘤细胞。,2.微胞干细胞杂交技术：

17、技术有待于改进 3.酵母人工染色体：未重排的Ig基因构建成酵母人工染色体，转入小鼠，获分泌人抗体的转基因鼠 微注射法 细胞融合法 此技术优于微基因法，但技术困难,（二）小鼠生产完全人源抗体的机制,抗体成熟经过两种特征结构改变 （1）抗原刺激下，体细胞超变：即可变区与抗原结合部位基因随即突变，再次产生抗体多样性。 （2）抗体类别转换：持续刺激，B细胞产生IgM转为IgG,人基因与鼠的基因重组与表达机制相容，但常规鼠优先表达内源鼠Ig，故需利用基因打靶技术鼠抗体表达。 转基因鼠技术利用鼠天然产生抗体多样性及选择机制，使其作用于人Ig，发生基因重排和超变。 运用常规免疫策略免疫该鼠产生高亲和力的完全

18、人源化抗体,获取人Ig基因：构建人Ig的YAC文库及筛选,小鼠胚胎干细胞培养,小鼠内源性Ig基因的敲除,获得完整人Ig-YACs克隆,Ig-YACs克隆小ES细胞的导入,纯合小鼠制备特异性完全人源化抗体,纯合小鼠的产生和鉴定,含人Ig-YACs的ES细胞的小鼠胚胎向小鼠体内送还嵌合,含人Ig-YACs的ES细胞移入小鼠胚胎,转基因通常有体细胞突变和其它独特的序列,导致不十分完全的人序列 产生单抗具有“鼠糖基化模式” 操作程序复杂,其他转基因鼠,HuMAb-Mouse是美国Medarex公司制备的含人Ig基因的转基因小鼠。这种转人抗体基因小鼠（Human antibody mouse, HuMa

19、b）构建方法与XenoMouse相似，是将小鼠的抗体基因换成人的抗体基因。HuMAb-Mouse含有编码人重链和轻链的关键基因序列，而自身抗体基因失活。其所携带的人抗体基因片段具有完备的功能，可以有效地进行同种型转换和亲和力成熟，任何靶抗原均可被用来免疫该小鼠，使其产生高亲和力的全人单抗。HuMAb-Mouse携带的人抗体基因非常稳定，可以传递给子代小鼠。,利用HuMAb-Mouse研制的全人单抗有2009年上市的抗TNF的Golimumab (Simponi戈利木单抗 )。另外，抗CD4单抗已进入临床试验阶段。,TC Mouse是日本Kirin Brewery（KHK）公司制备转染色体鼠。这

20、种小鼠的抗体基因已经被含有全部人抗体基因的人染色体替代，所以这种小鼠可以产生各种各样类型的全人抗体。 KM-Mouse是KHK公司的TC Mouse与Medarex公司的HuMAb-Mouse杂交后产生一种新的小鼠。KM Mouse具有从TC Mouse来源的人14号染色体片段（人Ig重链）和来源于HuMAb Mouse的Ig。KM Mouse能产生高亲和性的人源化抗体的大多数亚类，包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgA。,已上市的人源化抗体,靶向表皮生长因子受体(EGFR)的全人单抗（panitumumab ABX-EGF),用于治疗多种过度表达EGFR的肿瘤的治疗，如：结肠癌,

21、05年7月获FDA批准 ABXIL-8:靶向白细胞介素8(IL-8)的全人单抗,用于治疗自身免疫疾病(包括牛皮癣和类风湿关节炎）(Abgenix Inc）,抗体工程在制药工业应用一、 抗体治疗药物,以抗体为载体的导向治疗药物的研究已有20多年的历史,研究进展迅速.,抗体的治疗机制 （1）中和作用(Neutrilization) 用于感染性疾病，使病原体或其产生的毒素丧失致病力。 （2）示踪或导向作用Tracer or targeted effect 使与其相连的功能性分子特异性地激活或封闭、破坏靶细胞或靶分子。,（3）竞争性抑制作用/拮抗作用（Competitive inhibition） 与

22、体内产生或体外进入的物质结合，阻止其与靶分子作用产生毒性损害。 （4）抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应（ ADCC）及补体依赖性细胞溶解作用（CDC）。 （5）通过内影像作用模拟抗原，使疫苗更具安全性及广泛性。,（1）分子构成-抗体药物可分4类：,(1)抗体(裸抗体),根据人源化的程度，分为嵌合抗体、人源化抗体、完全人抗体。 (2)抗体片段，包括Fab ，scFv，diabody等。 (3)抗体偶联物(免疫偶联物),由抗体或抗体片段与“弹头”药物连接而成。 “弹头” 物质有放射性核素、化疗药物与毒素。这些“弹头”物质与抗体连接，分别构成放射免疫偶联物、化学免疫偶联物与免疫毒素。 (4)抗体融合蛋

23、白，由抗体片段和活性蛋白两个部分构成。,（2）可用抗体治疗的疾病,移植排斥,肿瘤,自身免疫病,心血管疾病,感染性疾病,过敏性疾病,银屑病：IL-8，CD11a，ICAM-3，CD80，CD2，CD3 RA：Complement（C5），TNF-，CD4 Crohn，s 病：TNF- 溃疡性结肠炎：47 SLE(红斑狼疮) ：C5，CD40L 多发性硬化症：VLA-4（整联蛋白） ，CD40L,（3）治疗性抗体的靶分子,自身免疫性血液系统疾病：CD64 哮喘：IL5，IL4，IgE，CD23 GVHD：CD147，CD2， 同种移植物排斥：CD3，CD25，2 integrin， CD4，CD1

24、47，CD40L，CD18 中风：2 integrin 青光眼手术：TGF-2,肿瘤 卵巢癌：CA125 结肠癌：171A 肺癌：GD3表位 头颈部癌：EGFR 乳腺癌：HER2/neu 肉瘤：V3 integrin CLL：CD52 AML：CD33 NHL：CD20，CD22，HLA，HLA DR,（4.）抗体药物的主要作用领域肿瘤,肿瘤治疗一直是抗体药物研发最活跃的领域。 1997年美国批准第一个抗肿瘤抗体药物Rituximab治疗NHL。 目前上市的抗体药物有10个以上用于肿瘤治疗，在临床2期或3期的中40%是抗肿瘤的，达数十种。 疗效最确切：Avastin（2004年，人源化，抗VE

25、GF）和 Erbitux（爱必妥, 2004年，嵌合，抗上皮生长因子）。,分类,1.细胞表面受体(或抗原)之抗体制剂：(1)抗-CD20 (Rituxan): (2)抗表皮生长因子受体EGFR(Cetuximab，施贵宝):正常和肿瘤细胞的表皮生长因子受体（EGRF,HER1,c-ErbB-1）相结合,竞争性抑制表皮生长因子受体与其他配体如转化生长因子的结合。 抗-HER2/neu (Herceptin, 贺癌平)等抗体。 (3)抗免疫逃逸分子CD47(“万能抗体”）,抗体药物通过多种机制发挥抗肿瘤作用： 抗体依赖细胞毒作用ADCC和补体依赖细胞毒作用CDCC等直接杀伤瘤细胞， 改变细胞信号转

26、导，诱导瘤细胞凋亡。 抗体还可以靶向运送细胞毒结合物直接杀伤瘤细胞。,Rituxan Mechanism,ADCC CDCC Apoptosis-binding causes cell suicide,B-Cells,CD20 Receptor,CD20 Receptor not present on B-Cell Progenitors,1997年美国上市的利妥昔单抗（rituximab）为重组嵌合抗CD20单克隆抗体，用于治疗淋巴瘤，标志着单抗已进入临床应用阶段。,EGFR,HER4,HER3,HER2,HER2,HER2,HRG,NRG-2 NRG-3,BTC EPR HB-EGF,EG

27、F TGF AR,人表皮生长因子家族成员及其配体,Tyrosine - kinase domain,EGFR (ErbB) family and ligands,Cysteine - rich domains,erbB-1HER1 EGFR,erbB-2 HER2 neu,erbB-3 HER3,erbB-4 HER4,C-Terminus,100 100 100,44 82 33,36 59 24,48 79 28,TRASTUZUMAB,CETUXIMAB西妥昔 PANITUMUMAB,Tyrosine kinase inhibitors (gefitinib, erlotinib),Mo

28、noclonal Antibodies (trastuzumab,cetuximab, panitutumab),Signal Transduction,R,R,K,K,Ligands,EGFR- targeting therapies,易瑞沙(吉非替尼，Iressa),EGFR Activation Enhances Pathways Important for Tumor Cell Growth,Panitumumab Inhibits Ligand Binding to EGFR and Dimerization,Panitumumab,Inhibition of EGF binding

29、 to EGFR,This may lead to: Cell proliferation Cell survival Angiogenesis Metastatic spread,EGF, TGF or other ligands binding to EGFR,A fully human* lgG2 monoclonal antibody to EGFR High affinity, KD = 5 x 10-11 M Inhibits ligand-induced EGFR tyrosine phosphorylation,Herceptin (抗体名称) 人源化抗体 HER-2 乳腺癌

30、cell,Herceptin + 化疗治疗乳腺癌的疗效,单独化疗 Herceptin + 化疗,有效率 32% 50% 中位有效期 6.1月 9.1月 1年死亡率 33% 22% 中位生存时间 20.3月 25.1月,抗CD47抗体可以通过阻断CD47向巨噬细胞传递不吃我信号而显著抑制实体瘤生长,人类癌细胞都表达CD47，相比于正常细胞通常以较高水平表达,Anti-CD47: A Way to Cure Cancer,急性髓系白血病AMI，慢性淋巴性白血病CLL高表达CD19,Chimeric antigen receptors (CARs) are fusion proteins consi

31、sting of antigen recognition moieties and T-cell activation domains.,CAR-modified T cells,TCR-CD3,2.抗血管新生或抗转移制剂： 抗血管内皮生长因子VEGF抗体(Avastin,贝伐单抗bevacizumab)也是第一个从抗体库中筛选出的 Fab 段抗体药物,（.）抗体药物的主要作用领域免疫性疾病,目前上市的用于免疫性疾病治疗者多达8种。主要通过结合免疫病理过程中的重要因子、阻断其功能而发挥作用。 TNF在很多免疫性疾病中起到重要作用，所以成为主要靶标。,Humira,2002年美国批准上市的一个全

32、人抗体药物Humira(阿达木单抗，雅培）通过结合TNF治疗早期的类风湿性关节炎RA。 后又批准银屑病性关节炎 05年批准用於治疗牛皮癣所引发的关节炎 2007年2月，FDA批准Humira增加新的适应症Crohn病，目前是临床治疗Crohn病（节段性回肠炎）的唯一生物制药,英国CAT公司与美国雅培公司研制 Adalimumab于2003年1月在美国上市，用于缓解抗风湿性药物治疗无效的结构性损伤的中至重度类风湿性关节炎（RA）成年患者的体征与症状，并可避免Remicade引起的恶心和脱发等不良反应， 2006年批准用于缓解活动期强直性脊柱炎（AS）患者的症状。2007年12月欧盟批准用于中至重

33、度斑块型银屑病。2007年，FDA批准增加新的适应症克隆病。2008年被批准用于4岁及以上中重度活动性多关节型幼年特发性关节炎（JIA）患者。,Remicade (Infliximab)类克,嵌合型抗体药物英利昔单抗 Remicade（强生，02年，史上第一支抗类风湿性关节炎发炎因子的药物）也是TNF抗体，适应症是过敏性肠道疾患Crohn氏病。 Remicade能与TNFa结合并中和TNFa的生理活性。Remicade还能够杀死合成TNFa的細胞。后者是Remicade具有強有效的抑制TNFa的作用机理。 TNFa在Crohn氏病和类风湿性关节炎中是引起和維持炎症反应的主要因素,1999年被美

34、国FDA批准上市，作为一种新型慢作用抗风湿药用于治疗类风湿性关节炎，后逐渐应用于其他慢性自身免疫性疾病，如银屑病性关节炎（2002）、强直性脊柱炎（2004）、溃疡性结肠炎（2005）、成人克隆病（2007）、幼儿克隆病（2008）等,(5.3)抗体药物的主要作用领域抗器官移植排斥反应,抗体主要通过阻断异体抗原的识别及排斥途径和分子机制中的某一环节，产生免疫抑制效应，预防排斥反应发生。 Tc共有的分化抗原CD3分子及IL-2R 对T细胞的活化、增殖起重要作用，因此抗CD3及抗IL-2R工程抗体的研究较为多见。,（.4）抗体药物的主要作用领域感染性疾病,主要针对病毒感染，帕利株单抗(Synagi

35、s, palivizumab, MedImmune 公司) 1998年被批准上市,第一株用于治疗病毒性疾病的人源化抗体,用于治疗儿童呼吸道融合病毒感染，2004年全球销售已近10亿美元。 由于疫苗和小分子药物的竞争压力，用于感染性疾病治疗的抗体药物相对滞后。 TNX-355 (Tanox公司)是CD4抗体，具有阻断HIV进入细胞的作用，目前已进入3期临床。如能成功上市，必将对小分子药物产生重大挑战。,Well-Characterized Monoclonal Antibody (B4) directed against HIV receptor complex for treatment of

36、 HARRT resistant AIDS patients through entry inhibition,新发传染病、慢性迁延性感染性疾病，以及病原体耐药性等不断出现的令人头痛的临床新问题有可能会刺激对抗体药物研发的新热潮。,2016年，美国FDA批准了。 美国Elusys Therapeutics公司的抗吸入性炭疽感染的Anthim（Obiltoxaximab）； 美国默沙东的降低梭菌毒素B感染风险药物Zinplava（Bezlotoxumab）。,（.5）抗体药物的主要作用领域血栓,礼来公司开发的药物ReoPro(abciximab) Reopro是一种糖蛋白IIb/IIIa 抑制剂

37、，主要用于预防进行冠脉血管成形术的患者发生缺血性心脏病并发症的高危险性。 Reopro可预防凝血相关的并发症，临床已证明该药可以减少病人的死亡率、心梗重复发作率、PCI的重复进行等。,抗血小板凝集的原理图,（）抗体偶连,以单抗介导的靶向性抗肿瘤药物正成为肿瘤生物治疗产业化开发的热点。,偶连细胞毒物质,连接放射性同位素(131I、99mTc锝 ） 连接植物或细菌毒素（ricin、PE40） 连接细胞毒性药物（C1027、柔红霉素）,TUMOR CELL,Fab,免疫毒素( 植物和细菌 ) 同位素( I131, I125, In111 ) 抗体导向化学疗法（甲氨喋呤,长春新碱,阿霉素） 裂解药物的

38、酶,-S-S-,.放射性同位素标记的抗体治疗药物,放射免疫治疗（RIT）是以能与肿瘤抗原结合的物质如单克隆抗体，作为靶向载体，偶联放射性核素的肿瘤治疗药物注射入体内与肿瘤细胞相关抗原特异结合达到对肿瘤杀伤而对正常组织损伤很小的一种治疗方法。 放射性单抗Zevalin（同位素钇90和CD20单抗 2002年）治疗对rituxan耐药的低分化非Hodgkin淋巴瘤。是携带放射性同位素与癌细胞结合，然后释放射线杀伤癌细胞。,1、NHL对射线高度敏感； 2、抗体除了与肿瘤结合外，还能够非特异性地与淋巴细胞结合。放射免疫螯合物发出射线直接杀伤肿瘤细胞，甚至能够杀伤邻近抗体阴性的肿瘤细胞； 3、抗体本身亦

39、有强大抗肿瘤效应； 4、淋巴瘤病人缺乏正常淋巴细胞及免疫力，发生HAMA的几率较其它肿瘤低。一般用鼠源性抗体作为核素的载体，原因是其从体内清除的速度较人鼠嵌合抗体快，避免了正常器官及骨髓受到过量长期的放射性照射,目前还没有最佳的适用于放射免疫治疗的同位素，归纳下来，可用于治疗的核素有以下几种： 131I，90Y，111In，125I，99mTc，212Bi，153Sm，177Lu，211At，32P，186Re，67Cu。 在非何杰金淋巴瘤治疗中常用的有131I、90Y、111In。,较为成熟且已经获得FDA批准正式用于临床的核素标记抗体包括：(Zevalin)（须同时联用111Inibrit

40、umomabtiuxetan以帮助显像），131I-anti-B1抗体（Bexxar）。 其它核素标记抗体包括：1、131I-LL2（抗CD22）。LL2结合CD22后易于内在化而使131I很快代谢，131I在肿瘤内停留时间减少而影响疗效。 使用易于驻留的标记核素，如90Y，对位于细胞内的抗原则更加有效。,.抗癌药物偶联的抗体治疗药物,1.常用的抗癌药物：氨甲喋呤; 阿霉素;丝裂霉素;环磷酰胺 ;新抑癌蛋白等。 2.近年发现抗肿瘤抗生素卡奇霉素Calicheamicin对肿瘤细胞的杀伤活性比阿霉素强1000倍。卡奇霉素与单抗构成的偶联物对多种肿瘤有良好疗效；2000年美国FDA批准用于治疗免疫

41、髓性白血病的Mylotarg（奥唑米星，辉瑞 ）就是CD33单抗与卡奇霉素的偶联物。售价：5mg,3200美金。2010年6月自愿退出美国市场,3、抗体导向酶前药疗法,前体药物（Pro-drug）是指该药物无治疗活性或仅有较低活性，需在体内经过代谢转化为活性型才可显示药物活性；优点是可降低毒性和延长药物体内的作用时间。 将单抗与特定的酶进行连接，先注入单抗一酶偶联物，间隔一定时间后再注入前体药物，使其在靶部位活化以杀伤肿瘤细胞。 还在临床前研究阶段，现已有单抗碱性磷酸酶偶联物合并磷酸丝裂霉素，单抗-胞嘧啶脱氨酶偶联物合并5-Fu；在临床试验中取得了较好效果。,抗体与酶分子偶联,Tumor ce

42、ll,enzyme,抗体与酶分子偶联,prodrug,drug,enzyme,Monoclonal antibodies as magic bullets,(7) 导向诊断药物,导向药物是由单抗与放射性核素(诊断用)、毒素或化学药物的偶合物，也可用破坏细胞结构的酶、细胞因子等连接，称为生物导弹，可特异地导向靶细胞的特定位点，发挥特意诊断和治疗作用。,OctreoScan(生长抑素受体显像技术) in a patient with metastatic small cell carcinoma of the prostate,Monoclonal antibodies, which are sp

43、ecific for a certain antigen, i.e. prostate carcinoma cells, can be tagged with a radioactive tracer, which when injected into the body will localize in areas of these recurrent carcinoma cells,大部分功能性内分泌肿瘤细胞富含生长抑素受体 1994年美国FDA批准111In铟 -DTPA-D-Phe1-octreotide (Octreoscan)成为正式药品,由于肿瘤的特异性小分子抗体尚在研究之中，所以导向药物还未在临床广泛应用。 SFDA批准进入临床的体内诊断用抗体,131I-抗人肝癌单克隆抗体(HAb18、Hepama-1） 9