布鲁氏菌试管凝集试验

1、布鲁氏菌血清学检验,山西省疾病预防控制中心 张秋香,免疫学基础,由于布鲁氏菌培养的营养条件苛刻而且时间长，所以布鲁氏菌的血清学诊断越来越受到重视。,主要是根据相应抗原抗体可以在体外发生特异性结合并呈现可见反应的原理,用已知抗原(或抗体)检测体液中未知的抗体(或抗原).由于试验时通常是用患者血清作为待检材料,所以检测抗原抗体的体外试验又称为血清学试验或血清学反应.,血清学检查既可协助早期诊断，还可确定是否复发或重复感染。 感染1-2周后，患者血清中出现IgM抗体，可以用凝集试验或抗人球蛋白试验检测 感染周后，患者血清中出现IgG抗体，可以用补体结合试验，荧光抗体或ELISA检测,虎红平板的凝集反

2、应（RBPT）,原理,该试验又称为班氏孟加拉红平板凝集试验。由于所用的抗原是酸性（PH3.63.9）带色的抗原，该抗原与被检血清作用时能抑制血清中的IgM类抗体的凝集活性、检查出的抗体是IgG类，因此提高了该项反应的特异性。,器材与试剂,虎红平板凝集抗原、被检血清、清洁脱脂玻片或有凹形孔的玻片、0.1ml吸管或微量加样器、混合棒或牙签,试验方法,在玻片上加0.03ml被检血清，然后加入虎红平板抗原0.03ml，充分混匀，在5分钟内观察结果。,(四) 结果判定,有二种方法，第一种是，出现可见的凝集反应就判为阳性； 另一种用“+”表示凝集程度按下列标准用加号记录反应强度： +：出现大的凝聚片或小的

3、粒状物，液体完全透明，100%凝集 +：有明显的凝聚片，液体几乎完全透明，75%凝集 +：有可见的凝集片，液体不甚透明，50%凝集 +：液体混浊，只有少量粒状物，25%凝集 -：液体均匀混浊,评价,此法简便、快速、容易操作，适于基层大面积检疫； 此法有一定敏感性，检查牛的阳性率稍高于绵羊、山羊。 因为在酸性环境下IgM活性受抑，该法主要是检查IgG类凝集抗体，所以特异性较好，与补体结合试验、二巯基乙醇（2-ME）试验和抗球蛋白（Coombs0）试验有较高的吻合率。 该法受制备抗原时条件影响较大，所以每批制备抗原应予以检查、标化方可应用。,试管凝集试验,试管凝集试验的原理1897年莱特氏等(Wr

4、ight)与其同事发现患该病的病人血清与马尔他细菌的培养物产生了凝集现象，遂称之为莱特氏凝集反应，成了迄今常用的血清学诊断方法之一。,设备及试剂,试管凝集抗原 被检血清 0.5%的石碳酸生理盐水 吸管 试管 试管架 孵箱,操作步骤,被检血清的稀释:一般情况下,每份血清用5支小试管,第一管加入2.3毫升石碳酸生理盐水,第二管不加，第三、四、五管各加入0.5毫升.用1毫升吸管吸取被检血清0.2毫升,加入第一管中,混匀。混匀后, 以该吸管吸取第一管中血清加入第二和第三管各0.5毫升，以该吸管将第三管混匀，并吸取0.5毫升加入第四管,依次稀释到第五管,混匀后从第五管吸出0.5毫升弃去.如此稀释后,从第

5、二管起血清稀释度分别为1:12.5 1:25 1:50 1:100,操作步骤,加入抗原:先以0.5%石碳酸生理盐水将抗原原液做适当稀释（一般是作1:10稀释）,稀释后的抗原加入各稀释的血清管（第一管不加，作为血清对照）,每管0.5毫升,混匀。加入抗原后，第二管至第五管每管总量为1毫升，从第二管起血清稀释度分别为1:25 1:50 1:100 1:200，从第一管再吸出0.5毫升，剩1毫升。 对照管的制作: 抗原对照（适当稀释的抗原加石碳酸盐水） 被检血清对照 阴性对照（阴性血清稀释后加抗原） 阳性对照（阳性血清稀释到原有滴度加抗原）,然后将试验管和对照管充分混匀后，放于37温箱中20-22小时

6、后取出，在室温下放置2个小时，以比浊管为标准判定结果。,结果的判定,判定比浊管的制备:每次试验须配制比浊管作为判定的标准依据. 配制方法是:取本次试验用的抗原稀释液（一般1:10）5-10毫升，加入等量的0.5%石碳酸生理盐水作倍比稀释，按下表配制比浊管 比浊管的配制,试管凝集反应标准比浊管配制,管号 抗原稀释液（ml） 生理盐水（ml） 透明度 标记 1 0.00 1.00 100% + 2 0.25 0.75 75% + 3 0.50 0.50 50% + 4 0.75 0.25 25% 5 1.00 0.00 0% ,结果记录,根据各管中上层液体的清亮程度记录结果，特别是50%清亮度（+

7、）对判定结果关系较大，一定要与比浊管对比判定 血清对照为清亮透明无沉淀,抗原对照为均匀混浊在两种对照管都成立的情况下，才可判定试验管，否则应重做。对沉淀需要经验判定。,“+” 几乎完全凝集，上清液75%清亮 “+”显著凝集，上清液50%清亮 “+” 微量凝集，液体25%清亮 “-” 无凝集，液体不清亮 确定每份血清滴度是以出现“+”及以上的凝集现象的最高血清稀释度,“+”完全凝集，上清液100%清亮,诊断标准,没有进行过菌苗接种的人、畜血清试验的标准是： 人、牛、马、鹿、骆驼等大家畜血清为1：100( +)及以上者为阳性，1：50(+)为可疑。 猪、羊(绵羊、山羊)、犬等小家畜血清在1：50(

8、+)及以上者为阳性，1：25(+)为可疑。 对可疑反应的人和动物应在10-25天内重复检查，以便进一步确定诊断。,影响试验结果的因素及注意事项,受检血清应新鲜、无溶血、无污染，存放血清处温度不能超过10，采血后应于34日内进行检查，因放置时间过长可能会导致血清效价降低。 遵守操作规程：所用的器材要清洁、干燥，试剂的加量一定要正确，放入温箱的温度和时间都要按要求，否则都影响结果。每份血清和抗原均要有对照。 高渗盐水作凝集反应，一般浓度在1012%，一般切记人血清不能用高渗盐水。,作凝集反应时，有个别血清会出现前带现象，即稀释度低的血清管内(或血清量多的格)不发生凝集，而稀释度高的管内(或血清量少

9、的格)出现凝集，这叫做前带现象。如果某血清在平板凝集反应中出现了前带现象，那么做试管反应时应多做几个管，多采用几个稀释度。 氯化钠的含量增高对血清反应有明显的影响，盐的浓度越高，反应的敏感性提高，因此在兽医界为了克服凝集反应中的阻抑抗体的干扰，对羊血清采用高渗盐水作凝集反应，一般浓度在1012%，切记一般人血清不能用高渗盐水。,前带现象产生的原因 胶体粒子学说：血清稀释度低所含的胶体粒子多，它影响抗原抗体的结合，而稀释度高的则含胶体粒子少，所以出现凝集。 不完全抗体学说：血清中因存在不完全抗体竞争抗原，所以在低稀释度的管中不凝集。 抗原抗体比例失调，也就是抗体过剩或血清内含有过多防腐剂，严重污

10、染可造成前带现象的产生，封闭抗原的干扰。,评价,该方法特异性较好，敏感性也高，因此适用于检疫和临床诊断。 由于该试验有时出现前带现象和封闭现象，所以有时也出现假阴性结果，必要时和其它方法联合应用。,抗原抗体反应的特点,抗原抗体结合的特异性,抗原抗体结合的基础是抗原决定簇与抗体的抗原结合部位之间 的反应.这种反应是专一性的.例如:布氏杆菌只能与布氏杆菌抗体相结合,而不能与痢疾杆菌抗体相结合.,抗原抗体 结合的表面性,抗原抗体的结合仅仅是分子表面的结合，虽然两者的结合相当稳定，但结合后的抗原抗体，其本身的结构，生物学活性均未遭到破坏,并且在一定条件下可解离.即抗原抗体的结合是可逆的,所以,解离抗原

11、抗体复合物的方法可用于 提取,纯化抗原或抗体.,抗原抗体结合的适当比例,抗原是多价的(分子表面有多个抗原决定簇)，抗体一般是双价的，(分子的末端有两个抗原结合部位)，所以，二者的结合就有一个比例关系问题只有抗原抗体比例适当，才能形成较大的，容易观察的复合物如若比例不当,就不能形成较大复合物.所以试验时要根据不同情况对抗原抗体(甚至两者同时)进行连续稀释,以便更好地提供两者最适的比例.颗粒性抗原,因其分子较大,形成可见的凝集物质所需的抗体较少,所以试验时一般把含有抗体的血清做连续稀释,尽管如此,有时还能在含有较多抗体的前列试管中,因两者比例不当不呈现可见反应,这种现象被称为前带现象.,抗原抗体结

12、合的阶段性抗原抗体的结合分为两个阶段第一阶段:特异性结合阶段,反应快,只需几秒或几分即可完成.但不出现肉眼可见的反应.第二阶段:抗原抗体结合的可见阶段,这一阶段的反应是可见的,反应较慢,常需几分钟，几十分钟或更久。,抗原抗体反应的影响因素,电解质；抗原抗体反应必须有适量的电解质参加，否则不出现可见反应，一般拿0.85化钠溶液做为抗原或抗体的稀释液。 温度：适当提高温度可以增多抗原与抗体的碰撞机会。促进反应现象加速出现。一般最适温度范围在0-56之间。在这个范围内，温度低，对反应的促进作用较小，但生成的复合物不易解离。温度高，对反应的促进作用较大，但生成的复合物容易解离。实际工作中，多数反应在37进行。在试验过程中，一般在加温之前，适度的振摇抗原抗体的混合液，也能增加两者之间的碰撞机会。 酸碱