种新的乙肝诊断血清免疫学指标－乙肝病毒大蛋白.ppt

1、一种新的乙肝诊断血清免疫学指标乙肝病毒大蛋白,乙型肝炎流行现状,乙型肝炎是一个严重的公共卫生问题。 全球60亿人口中，约1/2人口生活在HBV高流行区， 约20亿人证明有HBV感染，34亿人为HBV慢性感染，其中25%40% 最终将死于肝硬化和肝癌。 全球前10位疾病死因中乙肝占第7位，每年因乙肝死亡约75万例,中国乙型肝炎流行现状,(一) HBeAg阴性活动期肝炎增多 (二) HBV变异株增加HBV的突变率较高，,HBeAg阴性活动期肝炎,临床特点： (1) 转为肝硬化和肝癌比例较大； (2) 与年龄相关：患者年龄较大； (3) 疾病自发或持续减轻极少发生； (4) 何时停药难以确定； (5

2、) 治疗后复发率高。,HBeAg阴性活动期肝炎,HBeAg阴性乙肝与HBeAg阳性乙肝不同点： (1)慢性肝炎病情不减轻； (2)生化学和病毒学标志反复升高； (3) 可3040年无症状； (4) 约45岁左右发生肝硬化； (5) 10年后约25%发生并发症。,HBeAg阴性活动期肝炎,HBeAg 阴性的慢性乙肝流行率升高原因： (1) 持续免疫压力导致突变株选择； (2)长期治疗导致病毒变异； (3) 前C和C启动子变异； (4) 检测方法的灵敏度提高。,HBeAg阴性活动期肝炎,HBeAg 阴性活动期肝炎临床诊断现状： (1) 传统“两对半”指标不能反映此类患者HBV复制程度； (2) 缺

3、乏指导合理治疗的指标； (3) HBV DNA检测不易于各级医疗机构广泛开展； (4) 临床上急需能够反映HBV复制程度及指导治疗的指标。,抗病毒治疗效果监测,临床上用于抗病毒治疗的药物 干扰素 核苷类似物,抗病毒治疗效果监测,临床上缺乏评估抗病毒治疗效果的指标。 以HBV DNA阴转作为治疗的终点不恰当，此时停药病情易反复。,乙肝病毒实验室检测的缺陷,抗病毒治疗效果评价血清学指标缺乏 临床上评价抗乙肝病毒治疗效果时存在一个很大的问题，即其评价指标主要是肝功能的改善与否、血清乙肝病毒DNA水平的变化以及肝组织的病理学改变等。诚然，这些指标对临床医生判断患者病情而言非常重要和实用，也是临床医生选

4、用抗乙肝病毒药物时的依据， 然而对于何时停用抗病毒药物、停用抗病毒药物后乙肝病毒是否会重新复制活跃导致乙肝复发则缺乏客观而有效的指标。,乙型肝炎血清学诊断技术新突破,乙肝病毒大蛋白（HBV-LP）前S区 酶免定量试剂盒 -直接定量检测乙肝大蛋白 -不用分开检测前S1和前S2,HBV-LP诊断试剂新颖之处,采用病毒样颗粒制作针对构象结构的高活性抗体 同时检测前S1和前S2 进行定量检测，用于评估抗病毒治疗效果和预后 诊断HBeAg阴性活动期肝炎的唯一血清学指标 评估治疗效果及判定治疗终点唯一血清学指标 大蛋白完全消退意味患者预后良好,乙肝病毒包膜蛋白研究进展,1995-2004年 发现大蛋白前S

5、区有复杂构象结构 1996年 发现大蛋白具有反式激活病毒复制的作用 2002年 发现导致肝细胞病变及凋亡的主要原因是大蛋白 2004年 实验室成功构建针对构象型抗原的单克隆抗体 2005年 国内公司成功研制乙肝表面抗原大蛋白酶联免疫定量试剂盒,Hepatitis B乙型肝炎,HBV模型,HBV包膜蛋白,HBV的表面抗原的组成,HBV病毒结构成分,HBV-LP与病毒复制密切相关,根据检测血液中大蛋白的有无，判断病毒携带者体内的HBV病毒是否在进行复制。,乙肝病毒包膜蛋白 preS特性: 暴露在病毒颗粒表面 高免疫原性 参与了病毒与细胞受体的相互作用 诱导抗感染的保护性抗体的产生,Neurath

6、AR, Kent SB, Strick N, Parker K. Delineation of contiguous determinants essential for biological functions of the pre-S sequence of the hepatitis B virus envelope protein: its antigenicity, immunogenicity and cell-receptor recognition. Ann Inst Pasteur Virol. 1988 Jan-Mar;139(1):13-38.,乙肝病毒大蛋白和Pre-S

7、区的研究,Prange R, Streeck RE. Novel transmembrane topology of the hepatitis B virus envelope proteins. EMBO J 1995; 14: 247- 256 Lambert C.et al. Assessment of determinants affecting the dual topology of hepadnaviral lare envelope proteins J.General Virology 2004 85,1221-1225.,乙肝病毒大蛋白和Pre-S区的研究,HBV病毒颗粒

8、表面的PreS已经被证实具有独立的结构域和天然构象 很多研究致力于表达并观测PreS的结构，但是极少成功。其原因是单独表达的PreS很容易被蛋白酶所降解。,(A)内质网（ER）膜上乙肝大蛋白的拓扑结构模型 。 (B)病毒体包膜上的乙肝大蛋白的拓扑结构模型。 Volker Bruss, Xuanyong Lu1, Reiner Thomssen and Wolfram H.Gerlich.Post-translational alterations in transmembrane topology of the hepatitis B virus large envelope protein.

9、 The EMBO Journal vol.13 no.10 pp.2273-2279, 1994,乙肝病毒大蛋白和Pre-S区的研究,HBV L包膜蛋白（大蛋白）的结构域和穿膜拓扑结构 A. 大蛋白的构成组分，含preS1、preS2及S结构 B. 大蛋白在内质网（ER）膜上的拓扑结构,Carsten Lambert, Sylvia Mann and Reinhild Prange. Assessment of determinants affecting the dual topology of hepadnaviral large envelope proteins. Journal o

10、f General Virology (2004), 85, 12211225,乙肝病毒大蛋白和Pre-S区的研究,AA99169形成一个环状结构，这一序列横跨前S1和前S2，是其主要免疫表位。,乙肝病毒大蛋白和Pre-S区的研究,Volker Bruss Envelopment of the hepatitis B virus nucleocapsid Virus Research 106 (2004) 199209 29 September 2004,AA99169,L蛋白i-pre-S形式的功能模式图。 黑点表示L蛋白pre-S结构 略去S和M蛋白 分泌的病毒体表面的e-pre-S结构很

11、可能具有结合病毒受体的功能。目前的数据显示L蛋白的i-pre-S结构是一种蛋白矩阵，在病毒体的形成过程中负责与核壳体相接触，包装外膜。,VOLKER BRUSS* AND KERSTIN VIELUF. Functions of the Internal Pre-S Domain of the Large Surface Protein in Hepatitis B Virus Particle Morphogenesis. JOURNAL OF VIROLOGY, Nov. 1995, p. 66526657 Vol. 69, No. 11,肝炎病毒物种特异性的感染取决于病毒进入的水平，并由

12、病毒L蛋白上的pre-S结构决定。 Arg 103和Ser 124之间的序列在不同的HBV之间是高度保守的。 Arg 103和Ser 124之间的 pre-S序列对于HBV的形成具有重要功能。,横跨前和前之间,乙肝病毒大蛋白和Pre-S区的研究,VOLKER BRUSS. A Short Linear Sequence in the Pre-S Domain of the Large Hepatitis B Virus Envelope Protein Required for Virion Formation. JOURNAL OF VIROLOGY, Dec. 1997, p. 93509

13、357 Vol. 71, No. 12 TAKASHI ISHIKAWA AND DON GANEM. The pre-S domain of the large viral envelope protein determines host range in avian hepatitis B viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 92, pp. 6259-6263, July 1995,Determination of the Minimal Distance between the Matrix and Transmembrane Domain

14、s of the Large Hepatitis B Virus Envelope Protein Journal of Virology, June 2005, p. 7918-7921, Vol. 79, No.120022-538X,形成特殊的矩阵结构 跨膜区，维持它们正常结构的最短距离是个,乙肝病毒大蛋白和Pre-S区的研究,Pre-S的反式激活作用,乙肝病毒大分子表面抗原 （大蛋白）是一种转录活化因子,The hepatitis B virus large surface protein (LHBs) is a transcriptional activator. Virology.

15、 1996 Nov 1;225(1):235-9.,Bruns M,Miska S,Chassot S,Will H. Enhancement of hepatitis B Virus infection by noninfections subviral particles.J Virol ,1998;76 ;1462-8.,乙肝鸭模型证实由大蛋白组装成的亚病毒颗粒能够反式激活病毒继续复制 这个研究具有临床意义,对于大蛋白阳性而DNA阴性患者容易停药反跳具有参考意义.,亚病毒颗粒上pre-S的反式激活作用,原 文： Ultrastructural Analysis of Hepatitis

16、B Virus in HepG2-Transfected Cells With Special Emphasis on Subviral Filament Morphogenesis 作 者： PHILIPPE ROINGEARD AND CAMILLE SUREAU 作者单位： Laboratoire de Biologie Cellulaire, EP CNRS 117, Faculte de Medecine de Tours, 2 bis Boulevard Tonnelle,F-37032 Tours Cedex France. 发表刊物： HEPATOLOGY Vol. 28, N

17、o. 4, 1998,在乙肝病毒感染的HepG2细胞中对亚病毒纤维体的形态发生进行的超微结构分析,大蛋白与肝细胞病变研究,大蛋白的过量表达,管状颗粒在细胞内堆积,导致体外培养的细胞5天内死亡,Chisari等和Fernandes等已经证实，在转基因小鼠中过量表达大的表面蛋白会使肝细胞凋亡并且产生慢性肝炎。然而，在他们模型中的这种损伤相对比较温和，没有小鼠死于肝功能衰竭 . 转基因小鼠的肝细胞带有这种蛋白L的积累滞留，则会发展为细胞的损伤作用，它会诱导肝的再生，在这个模型中最终导致肝癌,大蛋白导致肝细胞病变研究,大蛋白是导致FCH中肝细胞损伤,纤维化的主要原因,FCH与肝细胞内大蛋白过量表达,蛋

18、白L的滞留也被发现和一种独特的综合症，即纤维淤胆性肝炎（FCH）相联系，它的特征为肝细胞的空气球化和有着显著的胆汁阻塞，但是它一般只有很少的炎症发生，它发生于免疫抑制的乙肝携带者。来自于发生了FCH的病人的肝脏样品，通过电镜观察发现在细胞内膜系统中有着同样的乙肝亚病毒包膜纤维体的积累。,2002年国际肝病杂志,实验证实，表达的乙肝大表面蛋白致使培养的肝细胞在一些天内死亡。 乙肝大的表面蛋白会致使体外培养的细胞的液泡化和细胞凋亡。这些结果和FCH下的肝脏病理情况相当地相似，,国内pre-S研究（部分）,文献一： Establishment and preliminery use of hepat

19、itis B Virus Pre S1/2 antigen assay World Journery of Gastroenterology 99年军事医学科学院所 文献二 xpression and purification of the complete preS region of hepatitis B Virus World Journal of Gastroenterology 2005年中科院上海生化和细胞所,抗原表位,目前生物科学领域，对天然表位的研究借助现代科学技术的进步，对表位已经有比较深刻的认识。 表位的构成方式至少有两种： 由某些氨基酸残基按一定顺序连续排列组成的线状序

20、列，称为顺序（sequential）表位或线性(linear)表位。顺序表位是蛋白分子的一级结构，比较稳定，不受蛋白质加热变性和空间构形改变的影响。 由分子内不连续的23个氨基酸残基折叠排列所形成的三维结构构成，称为构象(conformational)表位；有时候，呈螺旋式排列的连续肽链序列也可起到构象表位的作用。,多肽无法模拟构象表位,商品化的前S1 定性检测试剂上市，其单抗是用AA21-47化学合成的多肽而制作的。而应用该多肽免疫制作的抗体在科研中就已经发现，只能检测到微弱的抗-pre-S1抗体的产生,多肽无法模拟构象表位,Schodel等人曾以100ug的pre-S1(21-47)合成多

21、肽免疫Balb/c小鼠，诱导生成的抗pre-s1抗体的滴度只有160， 上海生化所改进应用pre-S1-BSA偶联复合物免疫Balb/c小鼠，也只能检测到微弱的抗Pre-S1的活力，,目前临床使用乙肝前S1以及前S2试剂,大部分研究主要集中在前S1区、前S2区。研究表明前S1区、前S2区蛋白及其抗体都与HBV-DNA、HBeAg、肝脏损害、乙肝的转归等都有极其密切的关系。 临床应用：前S1试剂、前S2试剂诊断的结果与HBV-DNA、HBeAg 三者之间有一定的关系，但符合率却只有0%，甚至更低。,杨海林等 完整病毒颗粒Dane颗粒标志物PreS1蛋白药盒的研制 上海医学检验杂志1995 vol

22、.10:204-206 杨海林等 抗乙肝炎病毒表面抗原PreS1（2047）多肽的制备、性质和应用。生物化学与生物物理学报 1994 vol 26 145-151,使用针对化学合成多肽的单克隆抗体， 无法定量监测，无法用于疗效观察 临床应用年，灵敏度不理想，,目前临床使用乙肝前S1以及前S2试剂,乙肝大蛋白定量诊断试剂,应用结构生物学、蛋白晶体学的研究，研发出针对乙肝病毒前S区的构象型单抗， 大大提高了乙肝病毒感染者中前S区抗原即LP大蛋白的检出率， 临床应用表明大蛋白的检出率与血液中病毒DNA的符合率高度符合（90%）。 比原来的前S1试剂效果大大提高，可作为病毒复制的一个指标。,乙肝大蛋白

23、re-S抗原蛋白晶体结构,HBV-lp晶体结构空间模型,针对大蛋白构象表位单抗研制简要过程（本方法是我们已经申请的专利的一部分）,获得体外重组的PRE-S抗原 获得多抗，亲和层析 从强阳性标本中获得病毒样颗粒 病毒样颗粒制作抗体,大蛋白试剂临床研究,1、HBV DNA阳性标本中HBVLP的阳性符合率,注：1 阿德福韦抗病毒治疗患者43例，共检出HBV DNA阳性152次； 2 拉米夫定抗病毒治疗患者51例，共检出HBV DNA阳性133次。,2、不同HBV DNA拷贝数中HBVLP阳性率以及OD值比较,大蛋白试剂临床研究,注：解放军传染病研究所，HBV DNA拷贝数对数值与HBVLP OD值的

24、相关系数,r=0.945,大蛋白试剂临床研究,注：北京地坛医院与沈阳传染病医院汇总，其中北京地坛医院为阿德福韦抗病毒治疗患者标本。HBV DNA拷贝数对数值与HBVLP含量（ng）的相关系数,3、不同HBV DNA拷贝数中HBVLP阳性率以及含量比较,r=0.935,大蛋白试剂临床研究,4、HBVLP试剂与乙肝前S1试剂比较,大蛋白试剂临床研究,大蛋白试剂临床研究,5、HBV DNA、HBeAg与HBVLP三者在乙肝患者中的比较,5、HBV DNA、HBeAg与HBVLP三者在乙肝患者中的比较,大蛋白试剂临床研究,注： # 其中北京地坛医院109份；沈阳传染病医院68份 * 其中北京地坛医院1

25、59份；沈阳传染病医院55份,6、不同HBV模式的患者中HBVLP与HBV DNA的比较,大蛋白试剂临床研究,大蛋白试剂临床研究,7、HBVLP试剂盒抗干扰能力的考评,注：* 含甲肝乙肝混合感染、丙肝乙肝混合感染以及戊肝乙肝混合感染各2份,8、HBVLP试剂盒的特异性考评,大蛋白试剂临床研究,大蛋白试剂临床研究,9、HBVLP用于抗病毒治疗的监测,北京地坛医院进行了阿德福韦治疗患者的过程监测 浙江湖州中心医院进行了拉米夫定治疗患者的过程监测 北京大学生物系进行了干扰素治疗患者的过程监测,北京地坛医院阿德福韦治疗监测,地坛阿德福韦治疗系列血清,典型病例,典型分析,药物治疗无效病例,治疗现有效果后反跳,治疗先有效后反跳,治疗先有效后反跳,治疗先有效后反跳,浙江湖州中心医院拉米夫定治疗监测,抗病毒治疗过程中HBV DNA阴转不能做为治疗终点的指标，HBV DNA阴转之后患者的病情会出现反