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文档简介
1、大肠杆菌感受态细胞的制备,一、实验目的,通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备的方法和技术,二、实验原理,处于对数生长期的细菌经CaCl2处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，接受外源DNA的能力显著增加。细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态 在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。 CaCl2法制备的感受态细胞简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于70保存（半年），因此CaCl2
2、法使用广泛,三、仪器、材料与试剂,超净工作台 冷冻离心机 恒温摇床 15mL移液管 1.5mL离心管 大肠杆菌DH5 0.1mol/LCaCl2溶液,四、实验步骤,受体菌的培养 感受态细胞的制备 感受态细胞的分装与冷冻,1、受体菌的培养,从LB平板上挑取新活化的E.coli DH5单菌落，接种于35mL LB液体培养基中，37下振荡培养过夜（12h） 将该菌种悬液以1：100的比例接种，取250L菌液转接到25mL LB液体培养基中，37振荡培养23h至OD6000.5左右,2、感受态细胞的制备,吸取4mL菌液转入15mL离心管中，冰上放置10min 在4下，4000r/min离心10min，弃去上清用冰上预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液10mL轻轻悬浮细胞，冰上放置30min 04 4000r/min离心10min，弃去上清，加入2mL预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置 将此感受态细胞分装成每份100L（1.5mL Eppendorf管），4 冰箱保存3h备用，每人至少一支 （或者在2mL制备好的感受态细胞中加入2mL30甘油，将此感受态细胞分装成每份100L（1.5mL Eppendorf管），快速转入70 冰箱保存）本次实验不采用 以上操作在超净工作台完
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