酶联免疫吸附试验.ppt

1、酶联免疫吸附试验（ELISA）,目录,一、 二、 三、 四、,酶联免疫吸附试验（ELISA）概述,酶联免疫吸附试验（ELISA）应用场景,酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程,全自动酶免工作站,一、酶联免疫吸附试验（ELISA）概述,基本概念： 抗原：抗原是指进入人或动物机体后，可刺激机体免疫系统发生免疫应答，从而引起动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。 抗体：是由抗原刺激动物的免疫系统后，由免疫系统产生分泌的能和相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。 酶结合物：酶与抗体或抗原、半抗原在交联剂作用下联结的产物,它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还能催化

2、酶促反应，显示出生物放大作用。,一、酶联免疫吸附试验（ELISA）概述,酶联免疫吸附试验，简称ELISA，是实验室最常用的检测方法。 酶是能够催化化学反应的特殊蛋白质，其催化效力超过目前所有人造催化剂。ELISA是将酶催化的放大作用与特异性抗原抗体反应结合起来的一种微量分析技术。酶标记抗原或抗体以后，既不影响抗原抗体反应的特异性，也不改变酶本身的活性。因此ELISA具有准确性高、检测时间短、价格低廉、判断结果有客观标准、结果便于记录和保存等优点，适合于大批标本的检测，广泛应用于食品安全检测、医疗检测以及免疫实验分析等领域。,一、酶联免疫吸附试验（ELISA）概述,基本原理： 抗原抗体的特异性结

3、合以及抗原或抗体的酶标记。,一、酶联免疫吸附试验（ELISA）概述,酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，可根据已知浓度的抗原或抗体的颜色反应的深浅绘制标准曲线并依此计算出未知样品中抗体或抗原的浓度。 测定对象：可以是抗原也可以是抗体。,二、酶联免疫吸附试验（ELISA）应用场景,1、食品、饲料： 农药残留（有机磷农药、氨基甲酸酯类农药）、兽药残留（青霉素、氯霉素、庆大霉素等）、添加剂（三聚氰胺、瘦肉精、孔雀石绿等）、真菌毒素检测（黄曲霉毒素、赤霉烯酮、呕吐毒素等）、微生物检测（如金黄色葡萄

4、球菌菌体细胞中的蛋白A等），等等； 2、医疗卫生： 检验科、肿瘤科、妇科、儿科、疾控中心、传染病医院、体检中心、肿瘤医院等（乙肝两对半、甲（丙、丁、戊）型肝炎抗体、梅毒、艾滋病甲胎蛋白、性激素六项等）。 3、畜牧行业：猪口蹄疫、猪蓝耳病、禽流感H5N1抗体、鸡传染性贫血；,三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程,试验流程：,样品、标准品以及试剂准备,加样,孵育,洗板,显色,比色,结果分析,三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程,例：饲料中黄曲霉毒素B1的检测：,样品、标准品以及试剂准备,加样(标准品/样品，酶结合物）,孵育，洗板,加入底物溶液A、B,加入终止液,吸光度测量,结果分析,粉

5、碎 称量 提取（振荡、离心） 样品稀释，待测,黄曲霉毒素B1酶联免疫试剂盒：冰箱取出，平衡至室温 （药品冷藏箱（28）,孵育,三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程,天平,粉碎机,电动振荡器,离心机,移液器,例：饲料中黄曲霉毒素B1的检测,三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程,饲料中黄曲霉毒素B1的检测：,样品、标准品以及试剂准备,加样(标准品/样品，酶标试剂）,孵育，洗板,加入底物溶液A、B,加入终止液,光密度（OD）测量,结果分析,三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程,饲料中黄曲霉毒素B1的检测：,样品、标准品以及试剂准备,加样(标准品/样品，酶标试剂）,孵育，洗板,加入底

6、物溶液A、B,加入终止液,光密度（OD）测量,结果分析,Or,37,孵育,三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程,饲料中黄曲霉毒素B1的检测：,样品、标准品以及试剂准备,加样(标准品/样品，酶标试剂）,孵育，洗板,加入底物溶液A、B,加入终止液,光密度（OD）测量,结果分析,孵育,三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程,饲料中黄曲霉毒素B1的检测：,样品、标准品以及试剂准备,加样(标准品/样品，酶标试剂）,孵育，洗板,加入底物溶液A、B,加入终止液,光密度（OD）测量,结果分析,孵育,三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程,饲料中黄曲霉毒素B1的检测：,样品、标准品以及试剂准备,加

7、样(标准品/样品，酶标试剂）,孵育，洗板,加入底物溶液A、B,加入终止液,光密度（OD）测量,结果分析,孵育,三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程,饲料中黄曲霉毒素B1的检测：,样品、标准品以及试剂准备,加样(标准品/样品，酶标试剂）,孵育，洗板,加入底物溶液A、B,加入终止液,光密度（OD）测量,结果分析,孵育,三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程,ELISA的比色测定主要由酶标仪进行。此处强调以下几点： （1）酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，室温宜在1530，使用前先预热仪器1530分钟，测读结果更稳定。各种酶标仪性能不同，使用前应详细阅读说明书。 （2）比色前应先用洁净的吸

8、水纸拭干板底附着的液体，然后将板正确放入比色架中，以免锈蚀酶标仪比色架。 （3）比色测定时，一定要注意酶标仪的波长是否已调至合适或所用滤光片是否正确。,三、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作流程,单波长或双波长比色选择的问题： 所谓的单波长比色即是通常的以对显色具有最大吸收的波长如450nm或492nm进行比色测定； 而双波长比色则在敏感波长如450nm和非敏感波长如630nm下各测定一次，最后酶标仪给出的数值为敏感波长下的吸光度值与非敏感波长下的吸光度值的差值。 因此，双波长比色测定具有能排除由微孔板本身、板孔内标本的非特异性吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色干扰的优点。,四、全自动酶免工作站,1、加 样 模 块 2、孵 育 模 块 3、洗 板 模 块 4、读 数 模 块 5、控 制 模 块（软件） 全自动-从加样、孵育、洗涤到数据处理打印报告都由仪器自动完成； 无污染-直接使用原样本试管和原试剂瓶，消除生物污染和试剂污染； 高效率-一次性处理样本量大；,医院,计生站,疾控中心,四、全自动酶免工作站,