胆总管结石的成因观察

胆总管结石的成因观察作者陈晓文，智发朝，曹东林，周思朗，陈勇伟,谢栋【关键词】胆总管EXPERIMENTALSTUDIESONCAUSESOFCALCULUSFORMATIONINCOMMONBILEDUCT【ABSTRACT】AIMTOOBSERVETHEROLESOFBACTERIALINFECTIONS,GASTROINTESTINALHORMONESANDBILEBIOCHEMICALFACTORSDURINGCALCULUSFORMATIONINTHECOMMONBILEDUCTMETHODSINTHISSTUDY,72PATIENTSWEREDIVIDEDINTO2GROUPSCBDSGROUP56PATIENTSWITHCOMMONBILEDUCTSTONEANDNCBDSGROUP16PATIENTSWITHOBSTRUCTIONOFCOMMONBILEDUCTBUTWITHOUTCBDSBILEASPIRATEDBYERCPFROMALLTHEPATIENTSWASCULTUREDAEROBICALLYANDTHECONTENTSOFTBA,CA2,P2ANDCHOINTHEBILEWEREDETECTEDSTONESOF11PATIENTSASPIRATEDBYERCPWEREINSPECTEDFORECOLIBYPCRTHESERUMMOTILINMTLANDTHESOMATOSTATINSSWEREMEASUREDBYRADIOIMMUNOASSAYIN52PATIENTSRESULTS53PATIENTS95OFCBDSGROUPAND8PATIENTS50OFNCBDSGROUPWEREPOSITIVEINBILIARYGERMICULTURESINFECTIONRATEINCBDSGROUPWASSIGNIFICANTLYHIGHERTHANTHATINNCBDSGROUPP005THREE27OF11PATIENTSWHOHADAPCREXAMINATIONHADPOSITIVERESULTSTHESERUMMOTILINLEVELOFTHEPATIENTSINCBDSGROUPWASSIGNIFICANTLYLOWERCOMPAREDWITHTHATOFTHEPATIENTSINNCBDSGROUP202151VS315161NG/L,WHILETHESERUMSOMATOSTATINANDBILECA2LEVELOFCBDSGROUPWERESIGNIFICANTLYHIGHERTHANTHOSEOFNCBDSGROUP155VS123NG/L,1409VS0703MMOL/L,P005TBALEVELOFCBDSGROUPWASSIGNIFICANTLYLOWERTHANTHATOFNCBDSGROUP126VS167NMOL/L,P005CONCLUSIONTHECHANGESOFBIOCHEMICALCHARACTERISTICSINTHEBILE,THEDISORDERSOFMODULATINGACTIONOFGASTROINTESTINALHORMONESANDTHEBACTERIALINFECTIONSMAYBETHERISKFACTORSOFCOMMONBILEDUCTSTONES【KEYWORDS】COMMONBILEDUCTCALCULI；BACTERIA；MOTILIN；SOMATOSTATIN；BILE；BIOCHEMISTRY【摘要】目的探讨细菌感染、胃肠激素及胆汁生化在胆总管结石形成中的作用方法实验分为胆总管结石CBDS组N56、非结石胆总管梗阻NCBDS对照组N16内窥镜下逆行胰胆管造影术ERCP中抽取胆汁作需氧菌培养及进行总胆汁酸TBA,CA2,P2和胆固醇CHO测定ERCP术中取结石用PCR法行结石大肠杆菌检测采静脉血行胃动素及生长抑素检测结果CBDS组56例胆汁标本需氧菌培养中，有53例检出细菌95，NCBDS组16例胆汁标本中，有8例检出细菌50，两组细菌检出率比较有统计学意义（P005）用PCR方法对11例CBDS患者结石进行大肠杆菌DNA片段检测，3例出现阳性27CBDS组血浆胃动素水平较NCBDS组明显偏低202151VS315161NG/L，而生长抑素则明显升高155VS123NG/L，组间比较差异显著（P005）CBDS组胆汁中CA2显著高于NCBDS组1409VS0703MMOL/L,P005,TBA则显著低于NCBDS组126VS167NMOL/L,P005结论胆汁理化性质改变、胆道感染及胃肠激素紊乱在胆管结石形成中可能具有重要作用【关键词】胆总管结石；细菌；胃动素；生长抑素；胆汁；生化0引言近年来，胆道细菌感染在棕色结石形成中的作用成为人们关注的焦点之一STEWARD等1运用扫描电镜首次证实棕色结石中存在细菌，TABATA等2检测发现100胆总管棕色结石中可检出细菌，提示细菌在胆总管结石COMMONBILEDUCTSTONE,CBDS形成中扮演重要作用；也有学者认为，胆结石形成可能与胆道动力异常和胆汁淤滞有关；近年来研究表明，改变胆汁酸组成和酸碱度可影响胆汁中胆红素及钙离子浓度，二者浓度过高，在胆汁中不能充分溶解，可促进胆汁核化和结石形成我们对胆总管结石患者菌群、激素水平及胆汁生化进行观察，以探讨其在胆总管结石形成中的作用1材料和方法11材料仪器设备BECKMANDU600型核酸蛋白质分析仪，美国BECKMANCOULTER公司；JM250型电泳仪，大连捷迈科贸有限公司；MODEL60全自动微生物鉴定仪，特康科技有限公司；OLYMPUSAU800型全自动生化分析仪，日本OLYMPUS公司；SN682型放射免疫计数器，上海核福光仪器有限公司；PERKINELMER480型DNA扩增仪，美国PERKINELMER公司；SANYOMDFU50V超低温冰箱，日本SANYO公司；UVITEC凝胶成像系统，英国UVITEC公司；TGL16G台式高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；电热恒温培养箱，广州医疗设备厂试剂DNAMAKER，大连宝生物技术有限公司；DNTP，上海生物工程技术服务有限公司；TAQDNA聚合酶，河南华美生物工程公司；胆汁酸HRWAKO，日本和光纯药工业株式会社；生长抑素及胃动素放射免疫检测试剂盒，解放军总医院科技开发中心放免所；细菌基因组DNA提取试剂盒，北京赛百盛公司12对象实验组2002年南方医院就诊CBDS（同时需排除胆囊结石或肝内胆管结石）患者56（男29，女27）例，年龄2282平均5715岁所有患者均通过腹部B超、CT或MRI检查，最后经内窥镜下逆行胰胆管造影术ENDOSCOPICRETROGRADECHOLEDOCHOPANCREATOGRAPHY,ERCP证实近期均未服用影响胃肠道动力的药物对照组2002年南方医院就诊非结石胆总管梗阻NOTCOMMONBILEDUCTSTONE,NCBDS患者16（男7，女9）例，年龄2586平均5515岁所有患者均通过腹部B超、CT或MRI检查证实胆总管扩张，ERCP证实胆总管内无结石近期均未服用影响胃肠道动力的药物两组性别年龄比较差异无统计学意义13方法131需氧菌培养患者行ERCP检查，注射造影剂前应用无菌导管入胆道，抽吸胆汁2ML，并接种在血平板上，37恒温箱中进行常规培养，48H观察结果，用MODEL60型全自动微生物鉴定仪进行鉴定132大肠杆菌DNA检测ERCP下取胆石标本N11，用无菌生理盐水冲洗三次，放入无菌试管中置于20冰箱中备用参照DONG等3方法，采用PCR扩增大肠杆菌DNA片段PCR体系如下常规配制含DNA模板15L，引物序列参照DONG等3报道，由上海生物工程技术服务有限公司合成，上游引物5TCTCTATGTGCATACGGAG3，下游引物5CCATACTGATTGCCGCAA3PCR循环条件943MIN，9460S，6530S，7245S，35个循环后72延伸5MIN用20G/L琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物，扩增片段长度为320BP133胆汁胃动素和生长抑素的放射免疫检测用预冷的注射器抽取患者（由于部分患者不配合，实际参与实验人数CBDS组N41,NCBDS组N12空腹静脉血2ML，置于含30L（2103万U/L）抑肽酶的预冷试管中，4低温离心15MIN4000R/MIN，取血浆分装于2个EPPENDORF管内，每管约05ML，编号后冻存于78低温冰箱保存待测检测方法参照试剂盒说明书进行134胆汁生化检测指标ERCP术中，注射造影剂前抽吸胆汁5ML，离心5MIN4000R/MIN，取上清，用OLYMPUSAU800全自动生化分析仪对胆汁中总胆汁酸TOTALBILEACID,TBA，CA2，P2，胆固醇CHOLESTEROL,CHO进行检测，其中CA2用MXB法，TBA用酶比色法，P2用钼酸直接法，CHO用酶法统计学处理细菌结果用统计软件SPSS110对数据进行卡方检验胃肠激素检测数据采用XS表示，作方差分析胆汁生化指标用XS表示，用两样本均数T检验进行统计分析2结果21胆汁需氧菌培养及菌种分析211两组患者胆汁细菌培养CBDS56例胆汁标本需氧菌培养53例检出细菌，检出率为95，15例检出2种细菌，共获68株细菌其中革兰氏阴性杆菌50株，占74；革兰氏阳性球菌17株，占25；霉菌1株，占1NCBDS16例有8例检出细菌，检出率为50，其中3例检出2种细菌，共获11株细菌埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、肠杆菌属和肠球菌属为胆道主要致病菌212结石中大肠杆菌DNA检测用PCR法分析11例CBDS患者结石，其中3例扩增出大肠杆菌基因片段，与标准大肠杆菌菌株DNA阳性对照带位置相同，形态一致其余8例无条带出现，扩增结果阴性，未发现大肠杆菌DNA片段存在，重复三次，结果一致图122两组血浆胃动素及生长抑素检测CBDS组血浆胃动素水平较NCBDS组明显偏低（202151VS315161）NG/L，而生长抑素水平较NCBDS组明显升高（155VS123）NG/L，有统计学意义P005）23两组胆汁生化测定CBDS组胆汁中CA2水平较NCBDS组明显增高P005，TBA较NCBDS组明显降低P005，两组间比较有统计学意义P005），P2和CHO则无显著性差异（表1）表1两组患者胆汁生化测定结果略3讨论正常情况下胆总管内无细菌生长，据文献4报道，在并发胆道感染时胆汁中可培养出一种或多种致病菌株，这些致病菌几乎都来自肠道，多为条件致病菌内镜下经导管抽吸胆汁进行细菌检测，国内已有较多报道，但有学者对其结果的可靠性提出异议本实验56例CBDS胆汁标本细菌检出结果与国内报道类似5本实验中，同样在胆道梗阻情况下，两组患者胆汁细菌培养阳性率差异显著，而混合感染率比较无统计学意义，提示胆道梗阻是合并感染、特别是混合感染的一个诱发因素，而不是唯一原因同时这些结果也表明CBDS患者较其它原因引起的胆道梗阻更易出现感染，间接提示胆道长期细菌感染可能与结石形成有关据报道，棕色结石细菌检出率可达90以上，但取棕色结石作细菌培养，通常得不到细菌存在的直接证据，PCR技术可大大提高结石中细菌的检出率本组11例患者结石中，3例发现存在大肠杆菌DNA片段提示PCR技术可提高胆石中细菌感染检测的敏感性有学者用电镜和PCR方法证实，胆汁或结石不同层面可出现不同细菌或菌株，说明细菌在结石形过程中扮演一定角色，有可能在结石形成前已有细菌感染，其机制可能是与细菌产生葡萄糖醛酸酶及磷酯酶有关细菌感染还可使胆管上皮细胞分泌紊乱，引起急慢性胆管炎、胆管运动功能障碍、胆汁瘀积、沉淀形成细菌代谢产物如聚多糖及黏蛋白可使细菌间相互黏附在一起，形成菌膜BIOFILM，对于棕色结石起凝聚和支架作用，成为结石核心胆道感染易造成胆道梗阻，而胆道梗阻又加重胆道感染，如此形成恶性循环，加快结石形成本实验结果显示，CBDS组血浆胃动素水平较NCBDS明显偏低，而生长抑素水平较NCBDS明显升高，提示胃肠激素紊乱与胆道结石形成有关动物实验研究表明，豚鼠体内胃肠激素在胆汁淤滞尚未发生之前已发生改变，提示胃肠激素的改变可能是导致胆汁代谢障碍的影响因素之一；CBDS组胆汁中TBA较NCBDS组明显降低，胆汁CA2浓度明显增高胆汁中TBA降低，不能有效地溶解游离胆红素及胆固醇，不能有效地与胆汁中CA2结合形成可溶性钙盐，使CA2浓度增高，而胆汁中CA2浓度增高，为非结合胆红素钙、软脂酸盐及硬脂酸盐增高提供了底物，导致胆汁中较易形成微胶粒，微胶粒达过饱和后形成结晶析出，最终导致结石形成两组胆汁中CHO无明显差异，说明棕色结石形成与CHO无明显关系，这与CBDS主要为棕色结石，其成分主要为胆红素钙相符【参考文献】1STEWARDL,SMITHAL,PELLEGRINICA,ETALPIGMENTGALLSTONESFORMASACOMPOSITEOFBACTERIALMICROCOLONIESANDPIGMENTSOLIDSJANNSURG,1987,20632422502TABATAM,NAKAYAMAFBACTERIAANDGALLSTONESETIOLOGICALSIGNIFICANCEJDIGDISSCI，19