皂角刺总黄酮诱导结肠癌hct116细胞凋亡作用研究（可编辑）

皂角刺总黄酮诱导结肠癌HCT116细胞凋亡作用研究目录L皂角刺总黄酮诱导结肠癌HCTLL6细胞凋亡的作用研究111中文摘要112英文摘要313前言614材料与方法1015结果1916讨论2617结论3418参考文献3519英汉缩略词对照表382致谢393皂角刺抗肿瘤作用机制研究新进展综述”40附L论文独创性及授权书50附2已发表综述5L四四删四四Y178475316细胞凋亡的作用研究皂角刺总黄酮诱导结肠癌HCTL摘要目的细胞凋亡，是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，由基因调控的主动死亡的过程，诱导肿瘤细胞凋亡是治疗恶性肿瘤的重要途径之一。皂角刺总黄酮FLAVONOIDS仔OMSPINA皂角刺中提取分离得到的黄酮类化合物，前期研究结果显示，皂角刺总黄酮对多种肿瘤细胞的增殖具有明显的抑制作用。本研究通过检测皂角刺总黄酮对体外培养的人结肠癌细胞HCTLL6增殖的影响，观察细胞凋亡的形态学变化、凋亡率和CASPASE3的活性水平变化，从细胞水平和分子水平探讨皂角刺总黄酮诱导肿瘤细胞凋亡的作用，旨在阐明其抗肿瘤作用的机制，为临床应培养，每3天传代一次。取对数生长期的细胞作实验对象，用不同浓度125、用CCK一8试剂盒CEUCOUNTING和HOECHST33258荧光染色观察诱导细胞凋亡的形态学变化，流式细胞仪刺总黄酮对细胞凋亡超微结构的影响，用CASPASE3活性检测试剂盒检测皂角刺总黄酮对凋亡细胞中CASPASE3蛋白活性的影响，并用统计学软件处理实验数据。结果不同浓度125、25、50、100、200MGLJ的皂角刺总黄酮处着药物浓度的增加，抑制作用越强，但以作用48小时的抑制作用最强，抑制7803士1038MGL，半数抑制浓度IC50为104096MGLI。皂角刺总黄酮作用于HCTLL6细胞48小时后，髓染色可见不同程度的核固缩、胞体变小、染色质凝聚深染和细胞贴壁率下降等改变。HOECHST33258荧光染色显示，不同浓度的皂角刺总黄酮溶液干预HCTL16细胞后，可见核浓缩、致密的强荧式细胞仪检测细胞凋亡率结果显示，皂角刺总黄酮可诱导HCTLL6细胞凋亡，凋亡率随着药物浓度的增高而变大，与阴性对照组比较，差异有统计学意义尸O01。黄酮处理后的细胞出现线粒体肿胀，细胞质浓缩，核固缩，核内染色质聚集于核膜内侧成团块状或新月状等凋亡改变。与对照组比较，CASPASE3蛋白的活性显著增强尸005，表明其可能参与了诱导HCTL16细胞凋亡的作用机制。结论皂角刺总黄酮能明显抑制人结肠癌HCTLL6细胞的增殖，且呈现出一定的浓度依赖性。皂角刺总黄酮能诱导人结肠癌细胞HCTLL6细胞凋亡，16细胞增殖和诱导其凋增强CASPASE3蛋白的活性。皂角刺总黄酮抑制HCTL亡的作用机制可能与增强CASPASE3蛋白的活性有关。关键词皂角刺；结肠癌；HCTLL6；增殖；凋亡FLAVONOIDSFROML6CENLINESINDUCEDONTHEOFHCTLBYSTUDYAPOPTOSISGLEDITSIAESPINATOTHECELLSINCERTAINORABSTRACTREFERSPHYSIOLOGICALOBJECTIVEAPOPTOSISTHEDEATHOFTHEIRO、VNINITIATIVEBYCONDITIONS，FOLLOWPROCEDURES，THEPATH0109ICALISANTOTREATCANCELWAYIMPORTANTAPOPTOSISGENEREGULATIONPROCESS，INDUCINGFSGISTHECHINESEHERBFROMGLEDITSIAEFLAVONOIDSSEPARATED行OMSPINAHASAOFTUMORCELLSHOW，FSGVARIETYGLEDITSIAE，PRELIMINA拶RESULTSSPINAF而MTHETHISL6CEUISSELECTEDSTUDYHCTLPROLIFERATIONSIGNINCANTLYINCULTUREDHUMANCOLONHUMANCANCERTHEFSGONDRUGSENSITIVECELLS，BYDETECTING爆LL6RATECANCERCELLSHCTCHANGES，THEOF印OPTOSISPROLIFERATION，MORPHOLOGICAL仔OMCELLULARAND。ANDLEVELSWEREOBSERVEDACTIVITYOF印OPTOSISCASPASE3INDUCEDMOLECULAROFTUMORCELLFSGBIOLOGYAPOPTOSISBYPROVIDING。，HCTLL6CELLSWEREEVIDENCEFORTUMORCOLONCANCERTHER印YMETHODSHUMANINFETALBOVINESEMM1OSTANDARDI冲MI1640MEDIUMCONTAINEDCULTUREDWITHANDASAMODEL，WITHDAYS37HUMIDIFIED5C02PASSAGEDEVE叫3ATMOSPHEREWEREUSEDFORTREATHCTLL6CELLSCELLSINCELLSEXPERIMENTS，THENLOGANTHMICPHASEARERANDOFFSG24，48WITHDIFFERENT25，25，50，LOO，200MGL。1CONCENTRATIONS1WITHCCK8116CELLRATEWASDETECTEDKITCEN72HOURSTHEHCTPROLIFERATIONWERETREATEDWITHDELTHCT1L6CELLSKIT8，ANDDRUGCOUNTINGOFTHEINDUCTION8TOOBSEI。VEHOECHST3325APOPTOSISANDSTAININGSTAININGANNEXINVPIDOUBLEWASASSAYCHANGES；FLOWC”OMETRYSTAININGMO叩HOLOGICALUSEDFORTHEOFCELLCACULATINGQUANTIFICATIONAPOPTOTICAPOPTOSIS；ANDCACULATINGDATAUSESSTATISTICALTHEEXPERIMENTALSOFTWAREDETECTINGAPOPTOSISOFFSGTRANSMISSIONELECTRONTHECELLS；BYMICROSCOPYDETECTINGAPOPTOTICINDUCEDFSGWITHASSAYCASPASE一3PROTEINACTIVITYBYCASPASE一3ACTIVITYKITRESULTSARERAND72HOURSTREATEDINDIFFERENT24，48OFHCTLL6CELLSTHEINHIBITIONRATESWERE125，25，50，100，200MGL。1BYFSG48IS1HOURS，THEINHIBITION，IC50DMGSSTRONGESTGRO叭H04O96MGLIWITHTHECANINHIBITTHEOFHCT116COMPAREDCONTROL伊OUP，FSGPROLIFERATIONTHEINCREASEINTHEROLECENS，WITHDNJGCONCENTRATION，THESTRONGERINHIBITION；FSGINHCT116CEUSARER48HOURS，HESHOWEDOFNUCLEARSTAININGVA哕INGDEGREESCELLCHROMATINCELLSTAINEDSTAINEDCONDENSATION，CONDENSATION，BODYSMALLERTHATARTTACHMENTRATEHASANDSO33258SHOWEDCHANGEDHOECHSTDROPPEDSTAININGTHESOLUTIONOFDI能RENTCONCENTRATIONSOFFSGINTERVENTIONONHCT116CELLS，NUCLEARDENSEOFNUCLEARSHOWINGENRICHMENT，CLUMPSSTRONGFLUORESCENCE，ANDBODIESANDOTHERCHARACTERISTICSOF丘AGMENTATIONAPOPTOTICMO印HOLOGICALDOUBLEFLOW印OPTOSISAULEXINVPISTAININGBYC”OMET巧SHOWEDTHAT印OPTOSIS，INHCTLL6ATTHEDI仟ERENTFSGCANCELLSTHEE仃ECTOFFSGINDUCE印OPTOSISCONCENTRATIONOF125，25，50，1，THERATESWEREOO，200MGL印OPTOSISRATESWITHANDINCREALSEDTHECONCENTRATIONTHE印OPTOSISDRUGINCREASINGLA唱ERANDTHECONTROLDI虢RENCEWASNEGATIVEGROUP，THESTATISTICALLY14SHOWEDT1EATEDTRANSMISSIONELECTRONTHAT，ARERWITH25，50MICROSCOPYANALYSISMITOCHONDRIALANDLCELLSSHOWEDSWELLING，FSGTHEOOMGL。1CHROMATININTHEIRULERCONDENSATION，NUCLEARCONDENSATION，NUCLEARAGGREGATIONINTOABLOCKORANEWANDSONUCLEARMEMBRANECHANGESH印EOF印OPTOSISGROUPWITHTHECONTROLWASACTIVITYONCOMPAREDGROUP，CASPASE一3PROTEININTHEINDUCEDHCT116CEUSBEINV01VEDTO印OPTOSISINCREASED尸IO05，THATMAYCANINHIBITTHEOFHUMANCOLONISTHEMECHANISMCONCLUSIONFSGPROLIFERATIONCANCERHCTLL6CELLSINACANINHUMANINDUCE印OPTOSISDOSAGEDEPENDENT；FSGHCT11ENHANCETHEOFCOLONCANCERCELLSPROTEIN；THE6，ANDACTIVITYCASPASE3INTHEFSGINHIBITIONOFTHEENHANCEDINVOLVEDACTIVITYCASPASE3PROTEINMAYBE1L6CELLANDMECHANISMOFHCTINDUCED印OPTOSISPROLIFERATIONL1GLEDITSIAE；COLONCANCER；HCTKEYWORDSSPINA_JL一月IJ吾世界卫生组织预测，全世界60亿人口中，每年约新增800万癌症患者，在未来几十年中，癌症死亡人数将显著增加，几乎每6秒钟就有一名癌症患者死我国最为常见和危害性严重的肿瘤为肺癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、大肠癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、白血病及淋巴瘤等。结直肠癌COLORECTAL是人类高发恶性肿瘤，其发病率一直呈上升趋势，在全球恶性肿瘤发病率中已上升至第三位，其死亡率居恶性肿瘤死因的第二位。在我国，结直肠癌死亡率已位于恶性肿瘤死亡率的第五位，严重危害人类健康，因此，研究皂角刺总黄酮的对结肠癌的增殖抑制和诱导凋亡作用具有重要的意义。目前对于肿瘤的治疗主要有手术治疗、药物治疗和放射治疗三大方法，药物治疗在恶性肿瘤的三大疗法中占有重要的地位，且发展速度最快。肿瘤的药物治疗主要包括化疗药物、中药、生物制品、基因药物和肿瘤靶向治疗。用于肿瘤治疗的化疗药物能够杀死肿瘤细胞，但缺乏对肿瘤细胞的特异性。抗肿瘤中药历史悠久，疗效确切，但目前还不能治愈肿瘤。生物制品主要集中在肿瘤或肿瘤血管靶向药物的研究，是肿瘤治疗研究的主要领域。肿瘤的发生与癌基因的激活和抑癌基因的失活有关，这也是基因药物治疗研究的主要方向。随着医药学的发展，肿瘤治疗药物的研究取得了很大进展，在合成的化学国际上临床常用的抗肿瘤药物有80余种，其中抗肿瘤植物药和辅助化疗的中药主要包括鬼臼毒素、紫杉醇、喜树碱、长春碱新碱、白藜芦醇、斑蝥素、靛玉兰、青蒿素、人参等，都具有明显的抗肿瘤活性，成为抗肿瘤药物市场上的主角【21。我国作为世界上中药品种最为丰富的国家，对于从中药中提取分离有效成分有着得天独厚的条件。我国的医药学家已经从天然药物中筛选出了数百种具有抗肿瘤作用的中药。临床常用抗癌中药有白花蛇舌草、夏枯草、七叶一枝花、风尾草、半枝莲、天冬、补骨脂、薏苡仁、黄芪、人参、党参、虫草、女贞子、丹参、当归、莪术、姜黄、柴胡、陈皮、雷公藤等等13】。从天然植物中寻找抗肿瘤活性成分，大规模快速筛选先导化合物，以及运用计算机辅助设计对从中药中提取的天然产物有效成分进行结构修饰和改造，是当前及今后一段时期内抗肿瘤药物研究的方向和热点。CELL细胞凋亡，又称程序性细胞死亡PROGRAMMED外某些因素触发的细胞内预存的死亡程序而导致的具有特殊形态学和生化改，变的一种细胞主动性死亡方式，早在1972年由英国阿伯丁大学KERR首次提出，细胞凋亡是生命的基本特征之一。现在认为肿瘤的发生不仅是分裂失控导致的细胞过度增生，同时也可能是细胞凋亡通路受阻，使本该死亡的细胞继续存在而产生肿瘤。近年研究发现某些中药能够有效地诱导肿瘤细胞凋亡，诱导恶性肿瘤细胞向正常表型分化【41是肿瘤治疗的新途径之一。与传统的细胞毒疗法相比，诱导分化治疗的目的不在于杀伤肿瘤细胞，因而具有较小的细胞毒性。陈竺等15】人发现砒霜治疗粒细胞增多的早幼白血病的机制是其中的三氧性早幼粒细胞白血病、人乳腺癌细胞、人食管癌细胞的凋亡17】；张长城【8】等研究发现皂角刺皂苷SSG对前列腺癌PC3细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用。人参皂苷对急性非淋巴细胞白血病细胞有不同程度的诱导分化不是杀伤肿瘤细胞而是诱导肿瘤细胞分化为正常细胞或接近正常细胞作用91，尤其对急粒单及单核粒白血病细胞的诱导分化作用较强。人参皂苷通过刺激正常红系、粒系祖细胞的增殖而促进血细胞生成，使化疗药物对白血病原始细胞的杀伤效果明显增强【LOL。SINENSIS皂角刺系豆科植物皂荚GLEDITSIAL锄的棘刺，含黄酮、皂荚皂苷、氨基酸、棕榈酸、硬酯酸、油酸、亚甾醇、谷甾醇以及二十九碳烷、酚类等，性味辛温，本草纲目载“辛、温、无毒”。功用主治为搜风、拔毒、消肿、排脓，现代医学研究发现皂角刺中的黄酮类化合物具有抗癌作用。中药皂角刺无论是在体内还是体外都对肿瘤细胞的生长具有抑制作用，其活性成分应该是其中的黄酮类化合物，主要为黄颜木素，皂角刺的水煮醇沉物和其他有机溶剂提取物。皂角刺热水浸出物对人体子宫颈癌培养株JTC6抑制率为5070，鼠肉瘤S180也有抑制作用，皂角刺和皂角树枝水煎剂可用来治疗鼻咽癌。从皂角刺的乙醇提取的体外抗肿瘤活性物质中，首次发现两种黄酮类化合物黄颜木素和3ACETOXYOLEAN12EN28OICACID，它们对体外培养的人肝癌细胞株HEPG2等7种肿瘤细胞的生长有较强的抑制作用【11】。还有研究发现，皂角刺的抗肿瘤作用可能与野生型P53基因和N师有关【12J，还能偶通过抑制肿瘤信号转导通路来抑制肿瘤的生长等【14151，这些研究结果为进一步研究中药的抗肿瘤作用机制提供了实验依据。虽然很多研究获得了重要的成果，但是传统的研究方法是用化学分离方法，从中药中分离得到单体化合物，在进行生物活性筛选，这种方法的缺点是耗时长、研究费用高、效率低。近年来应用的方法是化学分离与药理活性筛选相结合的方式，即先提取总成分，分类得到大类分或有效部位，将其进行药理活性筛选，再进一步分离得到单体化合物，大量的研究结果证明，这干4，研究方法比传统的随机筛选方法发现新药的机率要大，也更经济161，同时也可为设计更理想的新药提供独特的先导化合物。本研究若能达到预期目标，必将为皂角刺总黄酮在肿瘤治疗中的应用提供科学的实验依据，同时对进一步筛选高效低毒的新型癌细胞诱导凋亡药物具有重要的指导意义。材料与方法HCTLL6，购自中科院上海细胞所，用含LO在5C02，375的培养箱中培养，每23天更换培养液；待细胞单层生长铺满瓶底80左右时，O25的胰蛋白酶消化传代。112实验药品1皂角刺总黄酮性状，棕黄色粉末，纯度5029，味微苦，由泸州医学院药物研究所制备；2维甲酸6MGL，批号090708；11302；3青霉素华北制药股份有限公司，批号Y05LL；4链霉素华北制药股份有限公司，批号0503123主要实验试剂1I冲M11640GIBCO公司，批号1285082；2胰蛋白酶美国SIGMA公司3胎牛血清天津灏洋生物制品科技责任有限公司，批号20070112；4CCK8CELLCOUNTINGKIT一8碧云天生物技术研究所；12933258南京凯基生物科技发展公司，批号06L5HOECHST6AIULEXINVFITC试剂盒BECKMAN74多聚甲醛固定液博士德生物工程有限公司，批号200703088SABC试剂盒和DAB显色剂由武汉博士德公司提供；9酒精重庆北碚化学试剂厂，批号070406；10盐酸成都金山化学试剂有限公司，批号060300；110；16中性树胶中国上海标本模型厂，批号2006117二甲基亚砜DIMETHYL1限公司，批号5303；18苏木精染液、伊红染液、二甲苯、甲醛由泸州医学院附属医院病理科实验室提供。12主要实验仪器1倒置相差显微镜日本OLYMPUS公司生产，CKX41型；ELECTRICIN5AC；2C02培养箱SANYOCOLTD，MADEJAPAN，MCO13超净工作台苏州净化设备有限公司，SW二CJ1F型；4离心机北京医用离心机厂，LGLO3A型；5电热恒温干燥箱上海精宏实验设备有限公司，DHG9147A型；6磁力搅拌器南汇电讯器材厂，791型；7电子天平上海民桥精密科学仪器有限公司，FALL04N型；8超低温冰箱日本SANYO公司，MDF192型；9高压消毒锅上海申安医疗器械厂，LDZX40BI型；10一次性96孔培养板美国COMING公司；11酶标分析仪北京普朗新技术有限公司，DNM9602型；12荧光显微镜德国LEICA，DM4000B型13流式细胞仪BECKMANCOULLLER公司；14透射电镜型号日本电子株式会社，JEM1400型。2实验方法21溶液的配制211RPMLL640培养液的配制L取RPMI搅拌溶解，然后定容至LOOOML；加入青霉素100UML，链霉素100MGL_L，过清，PH为74。212O25胰蛋白酶的配制滤膜并分装，20冰箱储存，备用。213002MPBS的配制现用现配。214皂角刺总黄酮的配制精密称取皂角刺总黄酮粉末，临用前先用1的DMSO溶解，然后用生理盐水稀释至所需浓度；22细胞培养、传代、冻存、复苏221细胞培养C02条件下常规培养细胞呈单层生长，每23天换液一次，当细胞融合达80左右时传代。222细胞传代细胞生长至铺满培养瓶80左右时，吸除培养瓶内旧的培养液，加O25胰蛋白酶12ML覆盖满瓶底，镜下观察细胞回缩变圆、间隙增大时，吸除消化液，加适量加血清的培养基终止消化，吸管轻轻吹打使成细胞悬液，分装入23个培养瓶中，加适量培养液，37、5C02培养箱中常规培养。223细胞冻存常规方法将细胞制成细胞悬液并计数，调整使细胞密度达L5106ML左右，吸入离心管，1000转分，离心10分钟，弃上清，加入等体积冻存液70RPMIL64020胎牛血清LODMSO，吸管吹打使成细胞悬液，装入冻存管中，拧紧瓶口，封口胶封口，标记，放入4冰箱20分钟，20冰箱2小时，80冰箱过夜，次日放入液氮罐中保存。224细胞复苏从液氮罐中取出冻存管，迅速放入盛有3740水的烧杯，并不时摇动，尽快最好在一分钟内解冻，待细胞完全融解后，用75酒精的棉球擦拭冻存管后超净台上打开，吸出细胞悬液装入离心管，补加5ML培养液，低速LOOO转分离心5分钟，弃上清，加入适量培养液吹打使成细胞悬液，移入培养瓶中，加适量培养基，37、5C02培养箱中常规培养。23CCK8检测细胞增殖抑制率231细胞悬液制备LHCTLL6细胞采用含LO胎牛血清的I冲MI条件下常规培养。取处于对数生长期的细胞，O25胰蛋白酶消化，活细胞计数95，调整细胞悬液密度为L105ML，备用。232样品配制一备用。233细胞接种取备用HCTLL箱培养24小时。234加药黄酮终浓度为200MGL。1时相应的溶媒对照，以观察溶媒对细胞生长的影响，37、5C02培养箱继续培养48H。225检测每孔加入CCK8度A值，按下列公式计算抑制率，细胞增殖抑制率1A给药组A空白孔A阴性对照组一A空白孔】100，LOGIT法计算半数抑制浓度IC50。23脏染色法观察细胞形态学变化231细胞悬液制备条件下常规培养。取处于对数生长期的细胞，O25胰蛋白酶消化，活细胞计数95，调整细胞悬液密度为5104ML，备用。232样品配制125MGL1五个浓度，4冰箱保存备用。233细胞接种37、5C02培养箱培养24小时。234加药同时设皂角刺总黄酮终浓度为100MGL。时相应的溶媒对照，阴性对照组加等体积无血清RPMIL640，37、5C02培养箱继续培养48小时。234常规脏染色，步骤如下1吸尽孔内培养液，PBS洗，4多聚甲醛固定15分钟；2蒸馏水洗，苏木精染液染色6分钟；3自来水洗，1盐酸酒精分色，数秒；4自来水洗，碳酸锂或1的氨水染色1分钟；5自来水洗，伊红染液染色2分钟；水7取出爬片，二甲苯透明2次，每次1分钟；8封片载玻片上滴加中性树胶少许，把盖玻片细胞面向下置于上边，轻压，置阴凉处，待树胶自然干燥。9镜检观察光学显微镜下观察细胞形态、细胞质和细胞核的结构变化。24HOECHST33258荧光染色观察细胞凋亡形态241细胞悬液制备HCTL条件下常规培养。取处于对数生长期的细胞，O25胰蛋白酶消化，活细胞计数95，调整细胞悬液密度为5104ML，备用。242样品配制125MGL。五个浓度，4冰箱保存备用。243细胞接种取备用HCTL16细胞悬液接种于预先铺好盖玻片的24孔板，每孔加细胞悬液450PL，37、5C02培养箱培养24H。244加药MGL。时相应的溶媒对照，和125MGLL，同时设皂角刺总黄酮终浓度为200245HOECHST33258染色，步骤如下1吸尽孔内培养液，PBS洗，2分钟2次；24多聚甲醛固定10分钟，PBS洗，3分钟2次；HOCHEST3滴加25“L色10分钟，水冲净，晾干。246镜检拍照以紫外光340衄波长激发，荧光显微镜下拍照观察细胞凋亡形态学改变。25流式细胞仪ARULEXINVFITCPI双染法检测细胞凋亡率251细胞悬液制备条件下常规培养。取处于对数生长期的细胞，O25胰蛋白酶消化，活细胞计数95，调整细胞悬液密度为5105ML，备用。252样品配制125MGL。五个浓度组，4冰箱保存备用。253细胞接种取备用HCTL16细胞悬液接种于预先铺好盖玻片的24孔板，每孔450“L，37、5C02培养箱培养24H。254加药同时设皂角刺总黄酮终浓度为100MGL。1时相应的溶媒对照，阴性对照组加等体积的注射用生理盐水，37、5C02培养箱继续培养48H。255细胞的收集、染色，具体步骤如下清；24PBS洗涤1次；1500转分，离心5分钟，弃上清；PBS重悬细胞，置冰上；3LOO“L4阳性甲醛孔加3甲醛500“L，混匀，置冰上半小时；BU仃ERBU仃EROCONCENTRATED51BINDING17ML用蒸馏水稀释成LBINDING17ML，置冰上备用；IODIDE6用LM11BINDINGBUFFER将PROPIDIUM250PG溶解后置冰上备用；ARULEXIN7每L00“L细胞悬液加45“L上避光染色LO分钟；BU虢R，轻轻混匀，上机检测。8指标检测每管加380PL的1BINDING26透射电子显微镜检测凋亡细胞的超微结构115ML，1500RMIN，10分钟，25戊二醛4固定2H；2将瓶中的戊二醛倒掉，O01M磷酸缓冲液漂洗5MIN，三次；3倒掉剩余液体，在瓶中倒入1锇酸4固定3小时，固定后，蒸馏水漂洗LOMIN，三次倒掉瓶中的丙酮；6把组织块放入包埋板用包埋液包埋，经35过夜组织自然沉降，4512小时，6048小时聚合，标本完成制作，放入干燥器内保存；7用LEICA热膨胀式超薄切片机切片，厚度60NM。8切完的超溥切片放到铜网已泡二甲苯去脂，乙醇清洗，覆盖在1随机照相记录观察结果。书操作进行，测其OD值并计算活性。主要步6孔培养板，调整细胞悬液使密度为5105ML，24小时后，待细胞贴壁良好，对照组只加培继续培养48小时。2吸取培养板内的液体，PBS漂洗2遍；胰蛋白酶消化收集细胞；清液；4向收集好的细胞中加入冷的BU行ER50ML中，吹打使细胞分散均匀；5置冰上30分钟，并在漩涡振荡器上震荡30秒左右；至新的试管中并置冰上待用；7吸取50微升细胞裂解上清液，加入50微升的2REACTIONBU艉R使用前，每50微升的2REACTIONBU髓R加入O5微升的DDT；8加入5微升的C2LSPASE一3仪在405NM波长测定其吸光度值。28统计学方法学意义，0【005为检验水准。结果1皂角刺总黄酮对HCTLL6细胞增殖的抑制作用着药物浓度的增高，抑制作用增强。作用48小时后，皂角刺总黄酮对HCTLL6表L皂角刺总黄酮在不同时间点对HCTLL6细胞的增殖抑制作用IS，N3ATDI侬鹏NTTABL觚IPROLI向嘶衄OFFSGHCTLL6LKTINLESIS，N3WIMCON仃OLC伽叩A化DGROL叩，P005POOLF7”邑2墨A22置H苦孢舯加0MCONCENTN址IONMGL图L皂角刺总黄酮在不同时间点对HCTLL6细胞的增殖抑制作用C伽II“BITIONRATIO叫RVEOFFSGHCTLL6F远1CCLLS衅32HE染色结果在光学显微镜下，贴壁细胞由原来的梭形或多角形变小、变圆，核呈蓝色或蓝黑色，胞浆呈淡红色，核固缩、破碎，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象，出现形成凋亡小体。结果见图23HOECHEST33258荧光染色检测细胞形态在荧光显微镜下观察发现，阴性对照组细胞大小均一，成弥散均匀的淡蓝色弱荧光。经维甲酸和不同浓度的皂角刺总黄酮处理48小时后的HCTLL6细胞核明显皱缩，并可见致密强荧光，核固缩、破碎，胞质浓缩，有核碎裂和凋亡小体等强荧光团块，但皂角刺总黄酮在100MGL。浓度下，凋亡形态学改变略强于维甲酸。结果见图3NIIVFTCP4流式细胞仪ANNEXI双染法检测细胞凋亡率皂角刺总黄酮随着浓度的增加，细胞凋亡率逐渐升高，与对照组比较，差异具有统计学意义PO01。但在皂角刺总黄酮100MGL。1浓度下，凋亡形态学改变要略强于维甲酸，结果见图4、表2。表2皂角刺总黄酮诱导HCTLL6细胞的凋亡率IS，N3TAB2RATEOFFSGONHCTLL6CELLS孑S，N3APOPTOSISCONTROLCOMPARED诵THGROUP木尸005，奉尸001；COMPARED谢TH尸0055透射电镜观察细胞凋亡形态未经药物处理的细胞，胞浆内可见线粒体，糖原颗粒及少量空泡，细胞20总线破，变的TAB3OFHCTLL6CELLSTREATEDWITHFSGCASPASE3ACTIVITYWITHCONTROLCOMPAREDGROUP，牛尸O05尸O051，。，謦，。4，7F，L。謦。、JI、F之，J。，0J，却_，囊二，二，II，。，。、R；、0一、，。一矿一鲁1鼍，、，一；，簟，T0、_，、，I，I，I，磊。，CI酽7，1P一。嘲黟”一一，1，。；O，I；，_LI，；、歹、，。，7、，；，融I。0，IEFJKA对图2皂角刺总