树突状细胞及tnf-α在系统性红斑狼疮患者外周血的表达及意义

树突状细胞及TNF在系统性红斑狼疮患者外周血的表达及意义暨南大学硕士学位论文树突状细胞及TNF在系统性红斑狼疮患者外周血的表达及意义硕士研究生林桂艳指导教师邓列华教授摘要【背景与目的】随着免疫学研究的发展,树突状细胞在系统性红斑狼疮发病中的作用被关注。大量的研究表明在系统性红斑狼疮患者体内无论是B细胞异常引起的体液免疫反应还是T细胞异常引起的细胞免疫反应都与树突状细胞的功能改变有直接关系。树突状细胞,作为机体唯一能激活初始T细胞的抗原提呈细胞,在机体免疫系统中处于核心地位。本研究通过观察患者外周血树突状细胞表型及相关因子的表达,评价其在系统性红斑狼疮发病中的作用及临床意义。【方法】1、研究对象选取2009年10月2011年2月在暨南大学附属第一医院及南方医科大学南方医院的30例系统性红斑狼疮患者,同时选取30例年龄、性别与之相匹配的健康体检者作为对照NC组。所有研究对象均排除心血管疾病、糖尿病、肝脏疾病、代谢性疾病和其它免疫性疾病等。2、采用流式细胞仪分析SLE组与健康对照组外周血树突状细胞表面表达CD80、CD83、CD86、CD1A、HLADR阳性率情况。3、应用ELISA试剂盒检测SLE组和健康对照组外周血中TNF的浓度。I摘要【结果】1、DCS表面CD80、CD1A的表达在SLE组外周血比正常对照组比例增加,差异有显著性意义P005而DCS表面CD83、CD86及HLADR的表达比例在两组中无统计学差异P005。且CD80表达与抗DSDNA抗体滴度呈高度正相关,而CD1A表达与抗DSDNA抗体滴度无明显相关性。2、TNF在SLE组外周血比正常对照组表达浓度增加,两组差异有显著性差P005。TNF的表达量与抗DSDNA抗体滴度呈正相关,差异有统计学意义P005。3、SLE组外周血TNF的浓度与DCS表型CD80、CD1A的表达无明显相关性。【结论】1、流试细胞仪直接检测SLE患者外周血DCS与临床发病相关的表型表型表达情况CD80、CD1A与正常对照有明显差异,检测速度快,样本用量少,较常用培养外周血单核细胞来源DCS方法简便易行。2、外周血DCS的表型CD80的表达不仅与疾病发生有关,而且与疾病活动程度相关,可以用于监测治疗效果。3、SLE患者外周血TNF的浓度表达在SLE发病中具有一定的作用,并与疾病的活动性相平行,在临床应用TNF的拮抗剂治疗有一定的效果,但不能完全缓解SLE病情,且其可能是通过非CD80途径来实现治疗效果。【关键词】树突状细胞系统性红斑狼疮肿瘤坏死因子免疫反应II暨南大学硕士学位论文EXPRESSIONOFDENDRITICCELLSANDTNFINPERIPHERALBLOODOFPATIENTSWITHSYSTEMICLUPUSERYTHEMATOSUSNAMELINGUIYANSUPERVISORPRODENGLIEHUAABSTRACTBACKGROUNDANDAIMWITHTHEDEVELOPMENTOFIMMUNOLOGY,THEROLEOFIMMUNEINFLAMMATIONINSYSTEMICLUPUSERYTHEMATOSUSSLEATTRACTSPEOPLESINTERESTRECENTLY,ITWASDEMONSTRATEDTHATDENDRITICCELLS,WHICHAREKEYPLAYEROFTHEIMMUNEINFLAMMATION,WEREIMPLICATEDINTHEPATHOGENESISOFSLEPATIENTSTOELUCIDATETHEROLEOFDENDRITICCELLSINHUMANSLE,WECOMPARATIVELYSTUDIEDTHEMATURESTATUSEXPRESSIONSANDFUNCTIONALCHANGESOFDENDRITICCELLINTHEPERIPHERALBLOODOFPATIENTSWITHSLEANDHEALTHYCONTROLSMETHODS1STUDYPATIENTS30PATIENTSWITHSLEWERERECRUITEDFROMTHEFIRSTAFFILIATEDHOSPITALOFJINANUNIVERSITYANDNANFANGMEDICALUNIVERSITYFROMOCTOBER2009TOFEBRUARY2011HEARTDISEASES,LIVERDISEASE,DIABETES,METABOLICDISEASEANDTHEOTHERAUTOIMMUNEDISEASESWEREEXCLUDED30AGEANDSEXMATCHEDHEALTHYPERSONSWERESERVEDASNOMALCONTROLSNC2THEPHENOTYPESOFDCSINPERIPHERALBLOODWEREDETECTEDBYFCMFLOWCYTOMETRYINSLEPATIENTSANDTHENCSNORMALCONTROLSTHEYWERECD80、CD83、CD86、CD1A、HLADR3THECONCENTRATIONSOFTNFAREDETECTEDBYELISAKITSINPERIPHERALBLOODOFSLEPATIENTSANDTHENCSNORMALCONTROLSIABSTRACTRESULTS1DCSSHOWEDHIGHERPOSITIVECELLSWITHEXPRESSIONOFCD80ANDCD1AP005,WITHTHEOTHERMOLECULESCD83、CD86ANDHLADRSLIGHTBUTNOTGREATLYCHANGEDINSLEPATIENTS,COMPAREDTOTHECONTROLSP005BESIDES,THEREWASANPOSITIVECORRELATIONBETWEENLEVELOFCD80ANDANTIDSDNAINSLEPATIENTSP005,ANDTHEREWASNOCORRELATIONBETWEENLEVELOFTHEMOLECULECD1AANDANTIDSDNAP0052THEDATAOBTAINEDFROMELISASHOWSTHATTHECONCENTRATIONOFTNFINPERIPHERALBLOODOFSLEPATIENTSISHIGHERTHANTHATINNCGROUPP005BESIDES,THEREWASANPOSITIVECORRELATIONBETWEENLEVELOFTNFANDANTIDSDNAINSLEPATIENTSP005,ANINCREASEOFTHECONCENTRATIONOFTNFWITHINCREASEOFTHEPERCENTAGEOFANTIDSDNA3THEREWASNOCORRELATIONBETWEENLEVELOFTHEMOLECULESCD80ANDCD1AANDTNFINPERIPHERALBLOODOFSLEPATIENTSP005CONCLUSIONS1THEHIGHERPOSITIVEDCSWITHEXPRESSIONOFCD80ANDCD1AINPERIPHERALBLOODOFSLEPATIENTS,INDICATINGANIMMUNECHANGEOFDCSFROMSLEPATIENTS,ANDTHISMIGHTBEANINTRINSICFACTORTHATLIESINTHEPATHOGENESISOFSLETHISDETECTIONMETHODTHATTHEPHENOTYPESOFDCSINPERIPHERALBLOODAREDETECTEDBYFCMISALSOMORECONVENIENT2CD80MAYPLAYAROLEINTHEPATHOGENESISOFSLE,ANDITMIGHTBEAMAKEROFTHEDISEASEACTIVITYFORTHEPATIENTSWITHSLE3THELEVELOFTNFINPERIPHERALBLOODOFPATIENTSWITHSLEMAYPLAYAROLEINTHEPATHOGENESISOFSLE,ANDITISRELATEDTOTHEPROGRESSOFDISEASE,ITMAYNOTBEFUNCTIONALBYCD80PATHWAYTOACHIEVETHERAPEUTICEFFECTKEYWORDSSYSTEMICLUPUSERYTHEMATOSUSDENDRITICCELLSTUMOURNECROSISFACTORIMMUNITYII暨南大学硕士学位论文目录摘要ABSTRACT第一章前言11DC的生物学特性112DC在SLE患者体内的改变313DC在SLE发病中的作用414本课题研究意义6第二章系统性红斑狼疮患者外周血DCS表型及TNF检测21材料与方法722结果1723讨论2531结论32参考文献38附录攻读学位期间成果44致谢451目录2暨南大学硕士学位论文第一章前言系统性红斑狼疮SYSTEMICLUPUSERYTHEMATOSUS,SLE是一种典型的多器官受损害的自身免疫性疾病,多发于青壮年女性,皮肤、肾、肺、神经系统、浆1膜均可受累,临床表现多种多样。在SLE的发病过程中,不仅有T细胞参与,还有B细胞的高度活化,以至血清中可以出现多种自身抗体,并由此导致组织和器官损伤。在狼疮病情发展过程中,出现两个死亡危险高峰,早期的死亡危险高峰主要由肾小球肾炎、神经系统病变、感染等并发症所致,晚期则主要与心、脑血管事件有关。树突状细胞DENDRITICCELL,DC是目前所知的功能昀强的专职抗原递呈细胞,也是是体内唯一能够激活初始T细胞NAITIVETCEL1的抗原提呈细胞ANTIGENPRESENTINGCELL,APC,DC联系抗原和T淋巴细胞,使得抗原得以呈递给免疫细胞,成为激活免疫系统的“扳机点”,在免疫反应过程中起着枢纽作用。大量的研究表明在SLE患者体内无论是B细胞异常引起的体液免疫反应2还是T细胞异常引起的细胞免疫反应都与DC的功能改变有直接关系。11DC的生物学特性树突状细胞是免疫系统中一类重要的功能昀强的抗原递呈细胞APC,于1978年由STEINMAN和COHN首次发现,因其膜表面具有树突样或伪足样突起而得名见图1。DC并非一类细胞,其实际上代表了一个由数种表型和功能各异的细胞所组成的生物系统。按其分布部位及形态可分为郎格罕细胞、间质DC、滤泡样DC和血管DC等。按其来源,可分为髓样树突状细胞MDC和浆细胞样树突状细胞PDC两大类。正常情况下,未提呈抗原的树突状细胞处于未成熟状态,当受到外来抗原刺激,未成熟树突状细胞发育成熟为DC1/DC2,并激活T或和B淋巴细胞,从而诱导免疫应答反应。而免疫耐受是由于骨髓和胸腺中的阴性选择能够淘汰大多数对自身抗原特异的T和B淋巴细胞,自身反应性T细胞因接触树突状细胞提呈的自身抗原,处于功能受抑或无能状态,从而维持1前言3内环境稳定。DC的表面分子标志可因不同组织部位和成熟阶段而存在差异。研究较多的是成熟DC的表面分子标志,如黏附分子CD80、CD86、CD83、HLADR、CD1A。成熟DC主要诱导免疫激活,其表面高表达多种共刺激分子和黏附分子,包括CD80和CD86等。B71和B72均能与配体CD28及CTLA4结合而发挥共刺激作用。未成熟DC诱导免疫激活的能力很弱,但其可能在免疫耐受的产生中发挥了重要作用。体内DC在外周组织通过胞饮、受体介导等内吞及吞噬种方式摄取抗原,随后逐步分化成熟。DC在成熟过程中发生迁移,由外周组织进入次级淋巴器官,激发细胞应答。成熟DC的明显变化是在形态上呈现典型的毛刺状胞浆突起,细胞膜表面的MHC类分子、共刺激分子CD80/B71、CD86/B72及粘附分子上调,摄取完整的蛋白质抗原的能力显著下降。DC分泌的IL类、IFN及TNF等因子能趋化及激活T淋巴细胞,直接激活细胞毒性T淋巴细胞,从而参与抗感染免疫、肿瘤免疫、免疫排斥及自身免疫等多种免疫反应。如果DC递呈抗原多肽MHC未能提供有效共刺激信号,则使T淋巴细胞不发生增殖反应甚至凋亡而产生免疫耐受。因此,DC在免疫应答和免疫耐受中均发挥着重要作用。见图22暨南大学硕士学位论文12DC在SLE患者体内的改变已有文献报道,SLE活动期患者循环DC的总数明显低于正常对照组和SLE4静止期,且以PDC数量降低为著。SLE患者循环DC的数量虽显著减少,但其产物干扰素的表达却持续上升,可能是由于SLE患者PDC从外周血转移入组织内所5致,因此,近年DCS的迁移能力也受到一定的关注。GERL等的研究显示,SLE患者单核细胞和MDCS中表达CD86和B淋巴细胞刺激因子BLYS增高,PDCS和MDCS表达趋化因子受体CHEMR23降低,而检测DCS迁移能力的CCL19在PDCS表达则显著增高。从而提示SLE患者DCS的表型和迁移能力的改变导致DCS在周边组织的不规则分布,从而引发免疫反应和自身免疫失调。6JIN等分离58例SLE患者及62例健康志愿者循环PDCS并分别予中性粒细胞凋亡小体APOPMNS刺激发现,SLE患者PDCS与正常对照组相比刺激T细胞增殖能力增强,在异体T细胞培养反应中,甚至无需APOPMNS的刺激同时发现,SLEPDCSAPOPMNS组诱导分化调节性T细胞能力弱,表达IL6、IL10和IL18增高,以及出现TLR循环缺陷。这均证实了循环PDCS与SLE发病的密切相关性。3前言7YINGJNIE等则对MDCS作了一些研究,其分别用FTL3L和GMCSF/IL4培养SLE患者与健康对照者的骨髓来源树突状细胞MBDCS。结果显示,FL培养的MBDCS表达MDC和PDC两种特性,而GMCSF/IL4培养的表达MDC特性,提示在细胞分化的不同阶段均有大量异常表型和功能变化。相比正常对照组,SLE未成熟BMFLDCS表达CCR7增高,SLE未成熟与成熟BMFLDCS均高表达CD40和CD86,刺激T细胞增殖能力强而SLEBMMDCS表达CD40,CD86增高,但表达HLRDR降低,T细胞增殖能力降低。从而推测DCS的异常可能在骨髓BM阶段就已经发生,而BMMDCS的缺陷可能才是诱导SLE患者自身免疫的罪魁祸首。13DC在SLE发病中的作用免疫细胞是通过细胞因子相互作用的,其中肿瘤坏死因子TNF和干扰素IFN被认为在自身免疫疾病的发生中起重要作用。TNF被认为是引起类风湿关节炎的主要因素,抗TNF抗体已被用于该病的治疗并获得很好的效果。随后大量的研究证实IFN在SLE发病中有重要的作用,应用IFN治疗可以诱发SLE等自身免疫性疾病的发生,且SLE患者的血中存在诱导IFN产生的因素。131干扰素INTERFERON,IFN早在1979年,NOTKINS等就在自身免疫性疾病血清中发现大量IFN的表达。近811年来,大量研究均证实系统性红斑狼疮患者的血清中存在大量的IFN。有文献报道,可能由于系统性红斑狼疮体内的IFN相关基因过度表达,致机体产生大量12,13的IFN和IFN所致。国外有学者作了关于SLE患者与健康人群外周血IF基因表达情况的研究,证实SLE患者存在IFI基因过度表达,且IFI基因的产物TNF、14IFN与E2等细胞因子的水平明显高于健康人群。昀近,也有报道确定新发现一些遗传基因与SLE患者自身抗体和IFN的高表达密切相关,这些遗传因素在特定发病人群中表现了其强大的影响能力,在遗传分子水平上促进自身抗体及15,16IFN的产生,从而参与组织损伤。IFN可诱导DC分化成熟,将来自于凋4暨南大学硕士学位论文亡细胞核成分的自身抗原呈递,促进活化T细胞刺激自身反应性B细胞产生自身17抗体,逃避中枢清除,并活化自身反应性T细胞。成熟的DC还可活化细胞毒性T细胞,破坏组织从而产生凋亡小体,细胞凋亡或坏死后释放DNA、RNA及相关蛋白与自身抗体形成免疫复合物,导致组织损伤加剧。同时免疫复合物可作为内源性IFN诱导物,促进浆细胞样DCPDC进一步产生IFN更多,更多的IFN1820又进一步促进抗体产生、免疫复合物形成及PDC活化,形成恶性循。同时,有研究显示,IFN可上调DC等专职抗原提呈细胞及其他细胞表面MHCII类分21子表达,抗原呈递功能增强,从而促进炎症反应。而树突状细胞、巨噬细胞和TH细胞分泌的多种细胞因子之间有复杂的联系,IFN似乎也起一定的枢纽作用。132肿瘤坏死因子TUMORNECROSISFACTORA,TNFTNF是一种促炎细胞因子,通过与两种可溶性受体STNFR1和STNFR2结合而发挥作用。SLE可诱导细胞因子活化,包括TNF,其是疾病活动的生物标记之2223一。MAHMOUD等在对埃及女性狼疮患者的研究中发现,患者血清中TNF和STNFR2水平显著高于健康对照组。有研究表明,TNF和可溶性抑制剂TNF可溶性受体75KDA之间平衡的改变有利于对活动性狼疮的抑制作用。24SVENUNGSSON等的研究发现高TG和低HDL水平与TNF浓度及狼疮病情活动密切相关,故TNF水平增高可明显促进SLE的发生发展。还有研究表明,在系统25性红斑狼疮病情活动期中单核细胞TNF转录水平明显增高,从而可抑制内皮一氧化氮合成酶ENDOTHELIALNITRICOXIDESYNTHASE,ENOS活性,促进DC分化成熟,并使树突状细胞黏附、迁移显著增加。以上研究均显示TNF在SLE发病中有重要作用。成熟的DC是引发细胞免疫反应的关键。国内有研究报道利用TNF诱导DC分化成熟,经TNF培养刺激后,DC表面成熟表型CD54、CD80、CD86及MHC表面分子表达明显增加,使DC抗原摄取、加工及递呈能26力显著加强。由于成熟的DC不再摄取抗原,具有了向淋巴细胞递呈抗原刺激淋巴细胞的能力,因此可诱导较强的TH1和CTL反应,加速SLE的进展。5前言综上所述,DC是SLE发病重要影响因素,但确切关系尚未明确,还有很多细节有待于进一步深入研究。相信随着DC与SLE研究的更进一步深入,DC在SLE发病机制中的作用将越来越被重视,我们也期待能寻找到更多的治疗新靶点,为SLE患者带来希望。14本课题研究意义DCS在体内各组织中存在细胞量少,在外周血中DCS占有核细胞的比例低于1,给DCS的研究带来一定的困难。部分学者通过培养外周血单个核细胞PERIPHERALBLOODMONONUCLEARCELL,PBMC来源的DCS,在体外获得一定数量的DCS,并对来源于SLE不同阶段患者的DCS成熟状态及免疫功能作比较。随着流式细胞仪相关技术和试剂的高速发展,我们设想是否可以通过流式细胞仪直接检测分析外周血DCS表面表达的抗原分子情况,探讨DCS在SLE患者中的改变及作用,为SLE免疫发病机制的阐明奠定一定实验基础。本研究通过流式细胞仪对30例SLE组患者及30例NC组对照人群外周血DCS表面表达的抗原分子进行检测、ELISA试剂盒检测血清中细胞因子TNF浓度变化,分析两组不同人群DC功能状态上的差异,以进一步阐明DC在SLE的发病过程中的作用及临床治疗意义,旨在为SLE的免疫介导学说提供实验依据和免疫治疗途径,为SLE疾病的防治提供新的理论平台和技术手段,具有长远的经济价值和重要的社会意义。6暨南大学硕士学位论文第二章系统性红斑狼疮患者外周血DCS表型及TNF检测21材料与方法211系统性红斑狼疮患者外周血DCS表型检测2111研究对象1、入选标准2009年10月2011年2月在暨南大学附属第一医院及南方医科大学南方医院的30例系统性红斑狼疮患者,以上病例均符合1997年美国风湿病学会ACR修订的SLE的诊断标准。以及30例年龄、性别与之相匹配的健康体检者。2、排除标准心血管疾病、糖尿病、肝脏疾病及代谢性疾病等系统性疾病患者混合结缔组织病、系统性硬皮病、皮肌炎等其他自身免疫性疾病患者。3、病例分组SLE组30例明确诊断为系统性红斑狼疮患者,且排除上述疾病等条件。NC组30例年龄、性别与SLE组相匹配的健康体检者。表1美国风湿病学会ACR1997年度SLE分类标准1、颧部红斑固定红斑,扁平或隆起,在两颧突出部位2、盘状红斑片状隆起于皮肤红斑,黏附有角质脱屑和毛囊栓陈旧病变可发生萎缩性瘢痕3、光过敏日晒后皮肤过敏4、口腔溃疡经医生观察到的口腔或鼻咽部溃疡,一般为无痛性5、关节炎非侵蚀性关节炎,累及2个或更多外周关节,有压痛,肿胀或积液6、浆膜炎胸膜炎或心包炎7、肾脏病变尿蛋白05G/24小时或,或管型红细胞、血红蛋白、颗粒或混合管型8、神经病变癫痫发作或精神病,除外药物或已知的代谢紊乱9、血液病溶血性贫血,或白细胞减少,或淋巴细胞减少,或血小板减少7树突状细胞及TNF在系统性红斑狼疮患者外周血的表达及意义10、免疫异常抗DSDNA抗体阳性,或抗SM抗体阳性,或抗磷脂抗体阳性后者包括心磷脂抗体、或狼疮抗凝物阳性、或至少持续6个月的梅毒血清试验假阳性的三这种具备一项阳性11、抗核抗体在任何时候和未用药物诱发“药物性狼疮”的情况下,抗核抗体滴度异常。在上述前项中,如果有4项阳性包括在病程中任何时候发生的则可诊断为SLE。表2SLEDAI2000系统性红斑狼疮疾病活动性指数2000积分临床表现定义8癫痫样发作近期发作,除外代谢、感染及药物因素。8精神病严重的认知障碍,因而正常活动能力改变,包括幻觉、思维无连贯性、不合理,思维内容贫乏、无衔接,行为紧张、怪异、缺乏条理。需除外尿毒症、药物影响。8器质性脑病大脑功能异常,定向力、记忆力或其他智力障碍,急性起病,临床症状具有波动性,包括伴有集中力减退的意识模糊,对周围环境注意力不集中,加上以下至少2项认知障碍、语不连贯、嗜睡或睡眠倒错、精神运动增加或减少。需除外言代谢、感染性及药物因素。8视觉障碍SLE的视网膜病变,包括絮状渗出、视网膜出血、严重的脉络膜渗出或出血及视神经炎。需除外高血压、感染及药物因素。8脑神经新发的包括脑神经在内的感觉或运动神经病。8狼疮性头痛严重持续的头痛,可以为偏头痛,麻醉性止痛药治疗无效。8暨南大学硕士学位论文8脑血管意外新发的脑血管意外,除外动脉硬化。8血管炎溃疡、坏疽、痛性指端结节、甲周梗死、片状出血或血管造影证实存在血管炎。4关节炎2个以上关节疼痛及炎症表现,如压痛、肿胀或积液。4肌炎近端肌肉疼痛或无力与CK或醛缩酶升高有关,肌电图或肌活检证实存在肌炎。4管型尿出现颗粒管型或红细胞管型。4血尿红细胞5个/HP。除外结石、感染或其他原因。4蛋白尿蛋白尿05G/24H,新出现的蛋白尿或近期增加05G/24H4脓尿白细胞5个/HP。除外感染。2新发颊部皮疹新出现或反复发作的炎症皮疹。2粘膜新出现或反复发作的口或鼻溃疡。2胸膜炎出现胸膜疼痛、胸膜摩擦音或胸腔积液或胸膜增厚。心电图或超声心动证实。2心包炎心包痛,加上以下至少1项心包摩擦音、心包积液经2低补体CH50、C3、C4低于正常值低限。2抗DSDNA25FARR法或高于检测范围。抗体增高1发热38,需除外感染因素。9/1血小板降低10010L。91白细胞减少310/L,需除外药物因素。注上述积分为前10D之内的症状和检查。积分超过9分,即提示SLE病情活动。分数越高,病情越重。9树突状细胞及TNF在系统性红斑狼疮患者外周血的表达及意义2112实验材料1、主要试剂1PE标志小鼠抗人CD80抗体,美国BECTONDICKINSON公司产品。2PE标志小鼠抗人CD83抗体,美国BECTONDICKINSON公司产品。3FITC标志小鼠抗人CD86抗体,美国BECTONDICKINSON公司产品。4FITC标志小鼠抗人CD1A抗体,美国BECTONDICKINSON公司产品。5APC标志小鼠抗人HLADR抗体,美国BECTONDICKINSON公司产品。6IGGPE,美国BECTONDICKINSON公司产品。7IGGFITC,美国BECTONDICKINSON公司产品。8IGGAPC,美国BECTONDICKINSON公司产品。9FACS溶血素,美国BECTONDICKINSON公司产品。101PBS配制的1多聚甲醛。11洗液PBS缓冲液,EBIOSIENCE公司。2、主要设备及耗材1EDTA钠抗凝管。21275FALCON试管。3振荡混匀器。4台式水平高速离心机,德国EPPENDORF公司产品。5FACSCALIBUR型流式细胞仪,美国BECTONDICKINSON公司产品。6超净工作台上海净化设备有限公司产品。、7微量移液器及相应TIP10、20、100、1000UL,德国EPPENDORF公司产品。2113实验方法1、实验标本采集经确诊的患者及健康对照者,均晨起空腹采集肘静脉血10ML,以EDTAK2进行抗凝保存。10暨南大学硕士学位论文2、全血样本荧光抗体染色1按如下要求分别加入试管中TUBE1CD80CD83CD86CD1AHLADR10UL10UL10UL10UL10ULTUBE2IGGPEIGGPEIGGPERPIGGFITCIGGAPC10UL10UL10UL10UL10UL2加入全血100UL/管,轻轻振荡混匀,避光孵育2030MIN,3加FACS溶血素2ML溶解红细胞,作用10MIN,4300XG离心5分钟,弃去上清,5轻轻振荡混匀,加入PBS洗液2ML,6300XG离心5分钟,弃去上清,7轻轻振荡混匀,加入1多聚甲醛300UL,828避光保存,在24小时内上机分析。3、流式细胞仪检测开机前先装满鞘液筒,倒空废液筒顺序打开流式细胞仪和计算机仪器气路加压,排空气泡做FACSCOMP打开CELLQUESTPLOT软件,调出获取条件,FSC和SSC和选择LOG方式,根据细胞的FSC和SSC特性初步圈取淋巴细胞树突状细胞群们R1设定获取条件为“CD80PE、CD83PE、CD86FITC、CD1AFITC、HLADRAPC阳性。使用对照管调整FL1和FL2的PMT,使阴性群体位于FL1VSFL2点图左下角。调整FL1FL2和FL1FL2补偿顺序放置试验管,收集至5000个细胞,分析荧光强度,光散射数据存盘,测试后在计算机上用CELLQUESTPLOT软件分析数据,计算获得阳性细胞百分数表示。2114统计学处理计量资料数据分析结果以均数标准差XS表示,两组间均数比较采用T检验,变量间相关性采用PEARSON相关分析,以P005为差异有统计学意义。所有数据均采用SPSS130软件进行统计学处理。11树突状细胞及TNF在系统性红斑狼疮患者外周血的表达及意义212系统性红斑狼疮患者外周血细胞因子TNF检测2121研究对象1、入选标准2009年10月2011年2月在暨南大学附属第一医院及南方医科大学南方医院的30例原20例新10例SLE患者,以上病例均符合1997年美国风湿病学会ACR修订的SLE的诊断标准。所有患者采血前4周内均未系统大剂量使用过免疫抑制剂及皮质类固醇。以及30例原30例年龄、性别与之相匹配的健康体检者。2、排除标准心血管疾病、糖尿病、肝脏疾病及代谢性疾病等系统性疾病患者混合结缔组织病、系统性硬皮病、皮肌炎等其他自身免疫性疾病患者。3、病例分组SLE组30例明确诊断为系统性红斑狼疮患者,且排除上述疾病等条件。NC组30例年龄、性别与SLE组相匹配的健康体检者。2122实验材料1、主要试剂1人肿瘤坏死因子TNF酶联免疫分析试剂盒,美国RD公司产品。试剂盒组成1浓缩洗涤液20ML30倍1瓶2酶标试剂6ML1瓶3酶标包被板12孔8条4样品稀释液6ML1瓶5显色剂A液6ML1瓶6显色剂B液6ML1/瓶7终止液6ML1瓶8标准品450NG/L05ML1瓶9标准品稀释液15ML1瓶10说明书1份12暨南大学硕士学位论文11封板膜2片12密封袋1个2双蒸水或去离子水2、主要设备及耗材1EDTA钠抗凝管。21275FALCON试管。3振荡混匀器。4酶标仪450NM波长滤光片,美国BIORAD公司产品。5超净工作台,上海净化设备有限公司产品。6台式水平高速离心机,德国EPPENDORF产品。7微量移液器及相应TIP10、20、100、1000UL,德国EPPENDORF产品。8电子分析天平,广州华粤仪器厂产品。980医用低温冰箱,日本SANYO公司产品。1036恒温箱,美国SHILL公司产品。11坐标纸。2123实验方法1、实验标本采集经确诊的患者及健康对照者,均晨起空腹采集肘静脉血10ML,以EDTAK2进行抗凝,标本采集后立即摇匀,进行血浆和血细胞的分离,血浆分装于EP管内,80冰箱保存备用。2、SLE患者与健康人群外周血细胞因子TNF的测定1实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人肿瘤坏死因子TNF水平。用纯化的TNF抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入TNF,再与HRP标记的羊抗人抗体结合,形成抗体抗原酶标抗体复合物,13树突状细胞及TNF在系统性红斑狼疮患者外周血的表达及意义经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成昀终的黄色。颜色的深浅和样品中的人肿瘤坏死因子呈正相关。用酶标仪在450NM波长下测定吸光度OD值,通过标准曲线计算样品中人TNF浓度。2检测前准备工作1提前20分钟从冰箱中取出试剂盒,以平衡至室温。2将浓缩洗涤液用双蒸水稀释130。未用完的放回4。3操作步骤1试剂用前充分混匀,避免产生泡沫。2确定需要的微孔数,所有样本、标准品、空白和对照样本均取双份3标准品的稀释与加样在酶标包被板上设标准品孔10孔,分别加标准品100L至第1、第2孔,然后加标准品稀释液50L至第1、第2孔中,混匀然后从第1孔、第2孔中各取100L分别加到第3孔和第4孔,再分别加标准品稀释液50L至第3、第4孔,混匀然后从第3孔和第4孔中先各取50L弃掉,再各取50L分别加到第5、第6孔中,再分别加标准品稀释液50UL至第5、第6孔中,混匀混匀后从第5、第6孔中各取50L分别加到第7、第8孔中,再分别加标准品稀释液50L至第8、第9孔中,混匀后从第7、第8孔中分别取50L加到第9、第10孔中,再分别加标准品稀释液50L至第9、第10孔中,混匀后从第9、第10孔中各取50L弃掉。稀释后各孔为50L加样量,浓度分别为300NG/L,200NG/L,100NG/L,50NG/L,25NG/L。4加样分别设空白孔、待测样品孔。在酶标包被板上先加样品稀释液40L至待测样品孔中,然后再加待测样品10L样品昀终稀释度为5倍。加样将样品加于酶标板孔底部,尽可能不触及孔壁,轻轻晃动将其混匀。5孵育用封板膜封板后置36孵箱孵育30分钟。6配液将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。14暨南大学硕士学位论文7洗板小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。8加酶加入酶标试剂50L/孔,除外空白孔。9孵育用封板膜封板后置36恒温箱孵育30分钟。10洗板小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此洗板5次。11显色先加入显色剂ATMB50L/孔,再加入显色剂B50L,混匀后36恒温箱避光孵育15分钟。12终止加终止液18N硫酸50L/孔,终止反应。终止后1小时内这段时间在2至8避光保存或加入终止液后立即读取结果。13测定以空白空调零,450NM波长依序测量各孔的吸光度OD值。在酶标仪仪器保存读数结果并打印一份纸质结果。4计算以标准物的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上制作一条标准曲线,以平滑线连接各标准品的坐标点,通过样品的OD值由标准曲线查出相应的细胞因子浓度,再乘以稀释倍数或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出细胞因子浓度,再乘以稀释倍数,即为细胞因子的实际浓度。2124统计学处理计量资料数据分析结果以均数标准差XS表示,两组间均数比较采用T检验,变量间相关性采用PEARSON相关分析,以P005为差异有统计学意义。所有数