基因工程的基本操作程序.ppt

1.2基因工程的基本操作程序,专题1基因工程,（1）目的基因的获取,（2）基因表达载体的构建,（3）将目的基因导入受体细胞,（4）目的基因的检测与鉴定,基因工程基本操作程序主要包括四个步骤：,一、目的基因的获取,（一）目的基因：,主要是_的基因,编码蛋白质,如：与生物抗逆性相关的基因与优良品质相关的基因与生物药物和保健品相关的基因与毒物降解相关的基因与工业所需酶相关的基因,也可是具有调控作用的因子（如增强子等）,（二）目的基因的获取方法：,1、从基因文库中获取,（1）基因文库：,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。,（2）基因文库的种类：,部分基因文库,基因组文库,基因组文库：,包含了一种生物的所有基因，其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。,部分基因文库：,包含了一种生物的部分基因，如cDNA文库。,提取某种生物的全部DNA,用适当的限制酶切,一定大小的DNA片段,将DNA片段与载体连接,导入受体菌中储存,基因组文库,基因组文库的构建方法：,cDNA文库的构建方法-反转录法,某种生物的单链mRNA,合成互补DNA,形成双链DNA（即cDNA）,导入受体菌中储存,与载体连接,cDNA文库,逆转录酶（反转录酶）,DNA聚合酶,原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,启动子,终止子,编码区:能编码蛋白质的序列非编码区:不能能编码蛋白质的序列（含基因表达的调控序列）,知识补充：,真核细胞的基因结构,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能编码蛋白质的序列叫做内含子,内含子：,外显子：,真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点（启动子）。,非编码序列：,包括非编码区和内含子,基因组文库和cDNA文库比较：,（3）从基因文库中得到目的基因的方法：,依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA基因翻译产物蛋白质等特性,2、利用PCR技术扩增目的基因,（1）PCR技术：,是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，短时间内大量扩增目的基因。,（2）原理：,DNA双链复制,（3）条件：,DNA模板引物（一对）4种脱氧核苷酸Taq酶（耐高温的DNA聚合酶）缓冲液,（4）过程：,变性、退火、延伸三步曲,变性：,双链DNA单链DNA,5560,退火：,9095,引物与单链DNA模板结合(碱基互补配对),延伸：,7075,Taq酶的作用下，从引物起始进行互补链的延伸,（5）结果：,每循环一次，目的基因可增加一倍，呈指数形式（2n）扩增。,PCR扩增仪,PCR技术扩增与DNA复制的比较,碱基互补配对原则,4种脱氧核苷酸,模板、能量、DNA聚合酶,DNA在高温变性解旋,解旋酶催化,体外复制,细胞内,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,3、人工合成法,如果基因比较小，核苷酸序列又已知，也可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。,二、基因表达载体的构建基因工程的核心,1、构建表达载体的目的：,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代；使目的基因能够表达和发挥作用。,2、基因表达载体的构成及作用：,复制原点,目的基因,启动子,终止子,标记基因,启动子：,位于基因首端的一段有特殊结构的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位；作用：驱动基因转录出mRNA,终止子：,位于基因尾端的一段有特殊结构DNA片断。作用：使转录终止,标记基因：,为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来（如抗生素抗性基因）。,注意：启动子与终止子不同于起始密码和终止密码启动子与终止子位于DNA上，是DNA片段，与基因的转录有关。起始密码和终止密码位于mRNA上，是3个相邻的碱基，与翻译（蛋白质的合成）有关。,克隆载体与表达载体的构成：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在克隆载体基础上增加了启动子、终止子，启动子、终止子对于目的基因表达必不可少。,三、将目的基因导入受体细胞,1、转化：,目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。,2、常用的转化方法：,（1）导入植物细胞的方法：,农杆菌转化法（最常用）,a.农杆菌：,土壤中的一种微生物，自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。,b.农杆菌转化法的原理：,植物受伤时，伤口处细胞会分泌大量酚类化合物，吸引农杆菌，农杆菌Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,目的基因插入Ti质粒的T-DNA上,c.过程：,优点：经济、有效,基因枪法,单子叶植物常用的方法，成本较高。,花粉管通道法,简便经济（我国转基因抗虫棉）,（2）导入动物细胞的方法：,常用方法：,显微注射法,常用的受体细胞：,受精卵,目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射受精卵新性状动物,流程：,（3）导入微生物细胞的方法：,原核生物特点：,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,方法：,用Ca2+（或CaCl2溶液）处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子，完成转化。,四、目的基因的检测与鉴定,1、转基因生物DNA上是否插入了目的基因,（1）方法：,DNA分子杂交技术,（2）过程：,.提取转基因生物的基因组DNA.用放射性同位标记的目的基因的DNA片段做探针，与转基因生物的基因组杂交，若显示出杂交带，表明目的基因已插入染色体DNA中。,2、目的基因是否转录出mRNA,（1）方法：,分子杂交技术,（2）过程：,.提取转基因生物的mRNA.用放射性同位标记的目的基因的DNA片段做探针，与转基因生物的mRNA杂交，若显示出杂交带，表明目的基因转录出mRNA。,3、检测目的基因是否翻译成蛋白质,（1）方法：,抗原抗体杂交,（2）原理：,抗原与抗体的特异性结合,（3）过程：,.提取转基因生物的蛋白质.用针对目的基因表达的蛋白质（抗原）的抗体（放射性标记），与转基因生物的蛋白质（抗原）杂交，若显示出杂交带，表明目的基因已形成相应的蛋白质。,除了上述分子水平的鉴定，有时还需进行个体生物学水平的鉴定：,比如做抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性以及抗性的程度；或对基因工程产品与天然产品的功能进行活性比较，以确定功能是否相同,【特别提示】关注“操作程序”中的四个易混点(1)目的基因的插入位点不是随意的。目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位。(2)目的基因与载体相连接时，可能出现3种连接方式，如目的基因目的基因、目的基因载体、载体载体。为了防止目的基因或载体自连，基因工程中常用2种不同的限制酶对目的基因和载体进行切割，并保证目的基因的定向连接（启动子在其前，终止子在其后，保证