体外诊断试剂胶乳比浊法学习

胶乳免疫比浊法的知识许多公司已经开展了荧光乳胶免疫层析和乳胶增强免疫比浊法的定量分析，越来越多的技术人员开始关注乳胶标记技术。我总结了一些乳胶微球标记技术，并将其分类，供朋友参考：乳胶微球的物理吸附：带有磺酸基、羧基和醛基的反应微球是疏水性微球，可用于设计被动吸附蛋白。磺酸微球表面含有带负电荷的磺酸基团，pka约为2，因此它们在酸性条件下保持稳定。醛微球表面也有磺酸基团，但它们可以与蛋白质共价结合。羧基微球表面含有带负电荷的羧基，在pH5.0以上保持稳定具有疏水基团的蛋白质的吸附和配位是最简单和直接的标记方法。在该方法中，将微球溶液和含有目标蛋白质的溶液混合，并且在反应之后，通过清洗步骤去除未结合的游离蛋白质，以获得胶体蛋白质复合物。疏水吸附法只能用于疏水微球(由硫酸根、羧基和醛基修饰的微球)。醛表面修饰的微球是一种特殊情况，它们的疏水吸附结果取决于随后的共价结合。虽然物理吸附不依赖于酸碱度，但是反应缓冲液的酸碱度对蛋白质的结构有很大的影响，从而影响蛋白质吸附到微球上的反应效率。通常，在接近被吸附蛋白质的等电点的酸碱度下，物理吸附效率将非常高。反应步骤：1.使用反应缓冲系数为10毫克/毫升的蛋白质；2.反应缓冲系数达到1%乳胶微球；3.向乳胶微球溶液中加入蛋白质溶液，向10毫升乳胶中加入1毫升蛋白质溶液。搅拌并在室温下孵育2小时；4.离心或超滤除去未结合的蛋白质；5.将微球蛋白复合物溶解在储存缓冲液中。注意：1.最佳蛋白质标记量的影响因素1)有效比表面积：当粒径减小时，比表面积/mg微球值增加；2)胶体稳定性：蛋白质对胶乳有稳定和去稳定作用；3)免疫反应：根据免疫反应的需要确定最新的标记数量。2.在胶乳微球中加入蛋白质后，胶乳微球快速搅拌混合，有利于反应平衡。当反应体积为1毫升时，可以用移液管将蛋白质吸收并加入到微球中，并将微球吹几次。如果反应体积大，在用烧杯搅拌的同时加入蛋白质。3.当储存缓冲液和反应缓冲液不同时，抗体可能脱落；4.表面活性剂会使抗体从乳胶中脱落，因此应避免添加。微球与抗体共价结合的方法：单步1.用ph 6.0制备50 mm反应缓冲液，乙酸或MES缓冲液更合适。2.用反应缓冲液溶解抗体，浓度为1毫克/毫升。3.用反应缓冲液将微球悬浮至浓度为1% w/v。4.在搅拌下向10体积的微球悬浮液中加入1体积的抗体溶液，室温下继续搅拌20分钟5.配制浓度为10毫克/毫升(52微升/毫升)的EDC溶液，在使用前配制，现在准备使用。6.向上述微球悬浮液中加入具有计算需求的EDC溶液。(附注6)。7.室温下立即调节酸碱度(注释7)。8.去除未结合的蛋白质，用储存缓冲液重悬包被的微球。(附注3和4)B.两步过程为了避免EDC引起的相邻微球之间的蛋白质偶联导致微球的聚集或蛋白质之间的通讯，抗体的两步偶联更合适。在两步过程中，在添加蛋白质之前，多余的EDC被去除。在两步过程中，蛋白质也可以用较高的缓冲液溶解，这在蛋白质的稳定性和方便考虑加速蛋白质和活化微球之间的交联速度方面非常有利。B1简单一步法：1.制备ph值为6.0的50 mm活化缓冲液，乙酸或MES缓冲液更合适；微球用活化缓冲液悬浮至浓度为1% w/v。2.每毫升微球悬浮液加入20毫克EDC，在室温下孵育20分钟，然后再加入20毫克/毫升EDC，在室温下继续孵育20分钟6.向每毫升反应溶液中加入2.5微升乙醇胺，随后连续搅拌并在室温下温育10分钟。(附注9)。7.离心或超滤，用储存缓冲液悬浮，重复两次，除去未结合的抗体和乙醇胺。(附注3和4)B2。NHS中间体活化酯两步工艺在该方法中，在EDAC的存在下，NHS与微球上的羧基反应形成中间体活化酯。活性酯比EDC更稳定，不易水解。1.每毫升反应混合物加入以下成分：？加入DIW，恒定体积的最终体积为1毫升。？10x MES缓冲液0.1毫升，ph6.06.5(10X缓冲液通常为0.5m)；？0.1毫升10%微球(最终浓度1%)；？0.23毫升NHS水溶液(50毫克/毫升)；11.5毫克？一定体积的19.2毫克/毫升(100毫米)EDAC水溶液；2.室温下搅拌反应15-30分钟；(附注7)3.清洗：MES缓冲区或DIW被清洗两次；(注3)；4.用DIW冲洗悬浮的微球，直到浓度为1%；5.同时，用包被的缓冲液溶解和稀释抗体。缓冲液一般为ph79，50 mm 100 mm，最终蛋白浓度为1毫克/毫升。6.清洗微球后，立即加入一定体积的抗体溶液。(附注2).(注：本例中，微球浓度为0.5%(w/v)，蛋白质浓度为0.5毫克/毫升，缓冲液浓度为25 50毫米)；7.搅拌并在室温下孵育2hr；8.向每毫升反应溶液中加入2.5毫升乙醇胺，在室温下搅拌孵育10-30分钟；9.清洗：存储缓冲液清洗两次。(注3/4)附注：1.1 .反应缓冲液的组成根据蛋白质的类型而变化。常用的缓冲液包括乙酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液和MES缓冲液。蛋白质在等电点附近更容易吸附到微球上，因为在等电点附近蛋白质表面有更多的疏水位点。在这种情况下，抗体也更紧密，因此需要更多的抗体来标记到微球上。然而，最终反应缓冲液的选择需要考虑最终抗体微球复合物的生物活性。因此，应最佳选择几种不同浓度的抗体和不同的酸碱度反应缓冲液。在初始实验中，反应缓冲液的离子强度应为25 50毫米2.蛋白质溶液应在快速搅拌下快速加入微球悬浮液中。如果尺寸较小，可以进行调解和混合。当体积较大时，应在烧瓶或烧杯中更剧烈地搅拌，蛋白质溶液应迅速加入漩涡的中间。3.去除未结合的化合物或蛋白质。如果粒径大于0.2um，微球可以通过离心再悬浮，然后搅拌，随后进行温和的超声分散。离心力不应太大，否则会使微球不容易分散。它也可以通过超滤或透析进行纯化。当使用超滤时，滤膜的孔径应足够大，以允许游离蛋白自由通过滤膜。用于清洁微球的缓冲液应与储存缓冲液相同。用于清洗的缓冲液成分和酸碱度的任何变化都会导致蛋白质脱落。4.在微球被抗体包被后，添加表面活性剂或去污活性成分可能导致抗体脱落。如果共价结合到微球上，共价结合的抗体不会脱落。封闭蛋白，如牛血清白蛋白、酪蛋白或明胶，可用于封闭任何空的疏水位点，防止微球的非特异性聚集。然而，表面活性剂可以洗脱那些不能牢固共价结合的抗体。5.该试剂与水反应，因此，溶解后应立即使用。6.根据微球表面的羧基浓度计算EDC剂量。根据计算所需的量，每摩尔羧基应加入2-3摩尔EDC。然而，根据功能测试结果，需要进一步优化。7.在这个步骤中，经常可以观察到微球的聚集。因为在下一步，EDC将连接两个相邻微球上的抗体，导致微球凝集或中和微球表面的羧基，或两者兼有。调节6.5或更高并优化共价反应有助于微球的分散。如果在反应完成后仍然发生微球的凝集，过量的EDC和游离蛋白将通过用新鲜缓冲液洗涤而除去，这通常会使凝集的颗粒再分散。如果最终产品中仍出现凝集，首先尝试将微球稀释至最初的50%浓度。如果稀释后仍出现凝集，可将Tween20或Tergitol NP9等非离子表面活性剂加入所有反应缓冲液中。这些表面活性剂不会干扰颗粒的活性或共价结合，但是应该注意，在这种去污剂存在下，共价结合到微球上的抗体的稳定性应该得到保证。9.在蛋白质加成反应后，乙醇胺的加入可以与过量的羧基反应。乳胶标记过程中的常见问题：1)问题：蛋白质不能被吸附到微球上。解决方法：添加更多蛋白质；从微球中除去表面活性剂并释放被表面活性剂占据的蛋白质结合位点；引入中间体以连接微球和蛋白质；更改缓冲区。2)问题：在标记过程中添加了大量的蛋白质，但它仍然是无活性的。解决方案：改变蛋白质的添加量，从而改变蛋白质和微球结合的空间构象。表位稀释用于占据微球上的一些蛋白质结合位点，以防止蛋白质靠得太近。3)问题：微球在洗涤后聚集以除去未吸附的蛋白质。解决方法：增加蛋白质标记物或封闭剂的量以防止游离位点；4)问题：标记后活性开始变好，储存一段时间后活性降低。解决方法：将储存温度降至28度；降低存储液中封闭剂的浓度，防止抗体被替换；确认储存溶液中不能与抗体竞争的杂质，以防止抗体的长期替代。5)在5)聚苯乙烯微球与蛋白质(抗体)交联后，当时未发现凝集，但在一夜之间发现凝集。这是耦合效率低的原因。当系统蛋白质不足或由于其他原因，交联后在微球表面留下许多反应性基团，因为这些基团可以与连接的微球上的蛋白质反应，结果是微球再次被拉到一起，因此存在聚集。可以加入一些阻断剂来解决这个问题，通常是牛血清白蛋白。此外，微球的交联率也可以提高。然而，为什么凝集会在一段时间后发生？这是因为微球与蛋白质偶联后，由于带有相同电荷的关系，它们相对稳定(因此它们可以作为胶体存在)。只有当它们偶尔相互碰撞并遇到彼此的反应团体时，它们才能结合。6)抗体偶联到羧基聚苯乙烯球上，即时检测效果非常好，但在37度放置2天后，抗体活性似乎大幅下降。共价结合可能不成功，如果是这样，主要原因是质量差或EDAC过期。当EDAC被长时间放置在空气中时，它会吸收水分，水蒸气会减少EDAC的活动。另一个可能的原因是凝集。观察是否发生胶乳凝集。此外，交联蛋白以前洗过吗？我们提供的乳胶缓冲液含有表面活性剂，可能会干扰抗体结合。如果没有出现凝集，并且在使用前已经清洗过，我们建议使用新的EDAC。7)在7)EDC活化羧基胶乳微球后，加入的蛋白质(抗体)立即沉淀。原因是什么？添加蛋白质后，许多因素会导致微球聚集成块。通常，蛋白质偶联前的聚集与缓冲液(电解质)有关。羧基可能没有被很好地活化。EDC质量有问题，请用好质量再试一次。如果没有良好的EDC，可以适当降低活化缓冲液的酸碱度。对于未改性的微球，可以解决以下问题：大多数微球的制备过程中都加入了脂肪酸乳化剂。在聚合过程中，它充当乳化剂，聚合后，它充当稳定剂，以胶体方式分布微球。在碱性条件下，微球表面的COOH、脂肪酸分子上的COOH和聚苯乙烯聚链末端的硫酸根(SO42-)使微球表面带负电且亲水，从而形成稳定的胶体。通过添加蛋白质、阴离子乳化剂和非离子乳化剂(如Triton X-100和Tween-20)，可以实现缓冲引起的聚集。以下方法可供参考：a)在加入蛋白质之前加入少量乳化剂。具体数量可以自己决定。过多的乳化剂会占据微球表面，影响蛋白