流式细胞检测完整ppt课件

王丽2015-07-07,流式细胞技术FLOWCYTOMETRY,.,2,Whatdoesitmean?,FLOWCYTOMETRY：在液流系统中，快速测定单个细胞或微粒的物理特性和生化特性的方法。FlowCytometer(FCM)流式细胞仪FlowSorter流式细胞分选仪,.,3,BDFACSVantage,BDCalibur,流式细胞仪,BD流式细胞仪液流系统,BECKMANCytoFLEX,MiltenyiMACSQuant,Guava5HT微毛细管细胞分析仪,.,4,流式细胞仪的组成,Optics,Electronics,Software,.,5,样品规格：96孔板或1.5mL小管,进样准备,.,6,工作流程,样本制备荧光染色上样检测数据分析,FluorescenceDetector,Histogram,SingleCellSuspension,CellSuspension,FluorescentlyLabelledAntibody,BlueLaser(488nm),.,液流系统,功能：传送待测样本中的细胞到激光照射区。样本：0.2-150微米的粒子，最快可在1秒种内计测数万个细胞。,SheathFluid:10mL/TestWaste：1L/hrrun10万100万cells/Test,NoSheathFluidWaste：500nm,SP500=PEPerCPFITCPE较强，适用于弱表达抗原FITC最便宜，适用于强表达抗原,.,常见荧光物质的应用,.,直方图和点阵图,直方图(HistogramPlot)单参数分析.X-Axis:荧光信号强度.Y-Axis:细胞数目.,点阵图(DotPlot)双参数分析.XandYaxis：两种荧光信号强度.每个点代表一个细胞.,Log&Lin:荧光强度的坐标可以是线性的，也可以是对数的.,.,直方图：可根据单一因素区分细胞亚群,70cellseachhaveagreenfluorescenceintensityofabout400,Noticethesubpopulation?,.,25,血细胞分群（红细胞溶解后）,点阵图：根据多因素区分细胞亚群,.,荧光补偿,光谱重叠的校正：目前使用的荧光染料都是宽波谱，两两之间的发射谱范围有一定的重叠。为了克服这种误差，可使用荧光补偿电路，设置合理的荧光信号补偿。,.,27,我需要准备什么？,1.Why：为什么进行流式细胞检测？流式细胞技术是否是最佳的检测方法？检测的原理是什么？要检测的物质是什么？2.Where：荧光标记的物质在哪里？是否需要对细胞进行固定？打孔？3.Which：选择什么荧光标记物？4.How:样品制备流程，多少个标本？（空白对照、阴性对照）5.When:预约（175874947群共享下载申请表）Doit！（合适的细胞密度并避免细胞结团）,.,28,应用范围,细胞绝对计数和活力分析细胞增殖细胞周期细胞凋亡细胞毒实验抗原定量检测线粒体膜电位检测,.,29,实验对照的设计,空白对照ALL：采用不标记的细胞进行平行测定，用于确定待测标本的基础荧光域值或检测染色方法是否成功。阴性对照：调节各荧光探测器合适的放大倍数，即确定待测标本的基础荧光域值。常用同型对照（与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同亚型的免疫球蛋白），用于消除抗体与细胞非特异性结合产生的背景。阳性对照：用已知表达某种抗原的细胞（阳性细胞）进行平行实验，通常用于检测抗体是否正常或确定实验方法的稳定性和准确性。补偿对照：多色分析时，将用于多色标记的各种荧光抗体分别与样本进行单色标记，以测定荧光信号的光谱重叠情况以进行调节。单色分析：设同型抗体对照多色分析：同型对照，补偿对照,.,30,细胞周期：从一次分裂完成时开始，到下一次分裂完成时为止，为一个细胞周期。（细胞内的DNA含量随细胞周期进程发生周期性变化。）DNA含量：G1（DNA合成前期，2C）、分裂间期S（DNA合成期，2C-4C）、G2（DNA合成后期，4C）分裂期M期（DNA为4C）。利用核酸标记的方法，通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。但是分裂期（M期）的前期、中期、后期、末期四个时期，普通流式无法进行定量检测。,1.DNA细胞周期分析,应用实例,.,31,1.DNA细胞周期分析,.,32,实验步骤及注意事项：,1、细胞周期固定：加200ul细胞（贴壁培养的细胞需要先用胰酶消化）到1.5ml离心管中300g转速离心5min，并用1PBS清洗一次离心去上清添加300ulPBS溶解沉淀细胞缓慢加入20预冷的100%乙醇700ul固定细胞（固定过程中需要边滴加乙醇，边震荡，不要产生细胞聚团，否则会严重影响实验结果）最后乙醇终浓度为70%20孵育至少3小时（建议4孵育过夜，效果会更好）。2、将固定好的细胞300g转速离心5min，并用1PBS清洗一次。将细胞用200ul的Guava细胞周期试剂重新悬浮，室温孵育30min，注意避光。3、用200目细胞筛过滤细胞（如果使用PI染色必须过滤），显微镜下细胞无结团，Guava流式细胞仪检测。,1.DNA细胞周期分析,.,33,2.早期细胞凋亡检测,.,34,2.早期细胞凋亡检测结果,正常细胞：AnnexinV(-)/7-AAD(-)早期凋亡细胞：AnnexinV(+)/7-AAD(-)晚期凋亡细胞：AnnexinV(+)/7-AAD(+),CD95/FASL刺激诱导凋亡,.,35,实验步骤,1.样本准备(贴壁细胞)：弃去培养细胞(对数生长期)中的旧培养液，加入胰酶消化细胞，。收集旧培养基，通过离心获得凋亡或死亡细胞，与之后消化后的细胞混合，再检测。2.细胞染色：在96-well微孔板相应的孔中加入100ulGuavaNexin（货号：4500-0450）和100ul准备好的细胞悬液，室温避光孵育20min；尽快用流式细胞仪获取结果（1h内）。流式细胞仪检测获取数据。注意：实验最好包括实验组、阴性对照和阳性对照（凋亡诱导组）。,2.早期细胞凋亡检测结果,.,36,细胞凋亡,细胞凋亡是动态事件，在不同时期展现不同的凋亡信号。早期磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）暴露在细胞膜上，与PS结合的AnnexinV成为检测凋亡早期的最常用指标。除此之外，线粒体膜电位变化和细胞色素C的释放，也被认为是凋亡的早期信号。中期Caspase家族蛋白分布于各条凋亡通路上，是中期凋亡的指标。活化Caspase蛋白检测可以使用FLICA底物。晚期DNA片段化是凋亡晚期的显著特征。通过TUNEL法对断裂的DNA片段进行标记。,.,凋亡的途径,Caspase-8外源性TNF-alpha/FAS受体Responsetoenvironmentalcues,Caspase-9内源性细胞色素C的释放DNA损伤或细胞周期阻滞,Caspase-3/7关键的执行蛋白,MultiCaspasecaspases1,3,4,5,6,7,8&9的检测,Caspase家族蛋白酶是细胞程序性死亡过程中心点。,.,38,GuavaIncyteIC50/EC50自动分析,IC50即半数抑制浓