李丽娜开题完稿描述.ppt

应用全基因组改组技术选育肠道益生菌的研究,学生姓名：马颖辉指导教师：曹龙奎教授,目录,1.研究的目的和意义,2.国内外研究动态和趋势,3.试验研究的主要内容和方法,4.试验研究实施方案和进度,食品学院2009级研究生开题报告,5.试验研究预期效果,1.枯草芽孢杆菌研究意义,食品学院2009级研究生开题报告,2.全基因组改组研究的意义,一.研究的目的和意义,生长快、营养简单，能产生耐热抗逆的芽抱，这也有利于生防菌剂的生产、剂型加工及在环境中的存活、定殖与繁殖，而且批量生产工艺简单，成本也较低，施用方便，储存期长，是一种理想的生防微生物。,全基因组改组是近年来兴起的微生物遗传育种和菌种改良的一项新技术。该项技术通过微生物多个正突变体递进融合进行基因组随机重组，快速筛选所需表型有重大改进的菌株。,二.国内外研究动态和趋势,1.国内研究概况,2.国外研究概况,2007年胡雪萍等在比较纳豆芽孢杆菌营养体和芽孢之间的生物学特性时发现,芽孢对温度、酸碱度、盐和模拟胃肠道环境等不利环境的耐受性均明显强于营养体,可在模拟胃肠道环境中生长萌发。,日本学者用NTG诱变处理链霉菌U121的孢子,获得突变菌株的基因组库,然后通过三轮的基因组改组,获得的菌株产HCA能力比原始出发菌株产量高5倍以上,三角瓶培养显示细胞生长速度也获得了大幅提高。,食品学院2009级研究生开题报告,三试验研究的主要内容和方法,食品学院2009级研究生开题报告,1、枯草芽孢杆菌生长条件的确定。2、菌株产酶活性的测定。3、菌株紫外线诱变，选育高产酶菌株。4、菌株全基因组改组技术的研究。,三试验研究的主要内容和方法,食品学院2009级研究生开题报告,3.1枯草芽孢杆菌生长条件的研究,种子液制备250mL锥形瓶分装50mL基础LB种子培养基接种后，在37，160rpm的条件下震荡培养12h。以灭菌的基础种子培养基作为空白对照，测定菌液的OD600，作为培养条件优化的种子液。,菌种生长培养液配制及测定将种龄为12h的种子培养液按5%接种于装有6mL基础种子培养基的试管中。已接种的试管分别在各单因素条件下振荡培养，每隔两小时取样，测定OD600，达到菌种的最大生长量为止。以时间为横坐标，以OD600为纵坐标，绘制菌种生长曲线，使菌种在短时间内达到较大生长量者为最适生长条件。,温度,pH,摇床转速,接种量,装液量,种龄,实验方法,食品学院2009级研究生开题报告,食品学院2009级研究生开题报告,实验方法,3.2菌种产酶活性测定,3.2.1蛋白酶活性测定,3.2.2淀粉酶活性测定,3.2.3纤维素酶活性测定,3.2.4脂肪酶活性测定,食品学院2009级研究生开题报告,实验方法,3.3紫外线诱变,出发菌株斜面洗下孢子过滤除菌丝制成孢子悬浮液紫外线诱变转无菌管02h后培养稀释涂平板暗培养24h初筛复筛高产酶菌株生化鉴定遗传稳定性,食品学院2009级研究生开题报告,实验方法,3.3紫外线诱变,1.紫外灯照射时间对诱变的影响,2.筛选步骤,UV第一轮：一株出发菌株选出200株单菌落初筛选出60株复筛选出五株UV第二轮：五株出发菌株540株初筛选出60株复筛选出五株第三、四轮同第一轮直至选出较优菌株,食品学院2009级研究生开题报告,实验方法,3.4全基因组改组技术,出发菌株斜面洗下孢子过滤处菌丝制成孢子悬浮液预处理酶解稀释涂平板初筛复筛高产酶菌株生化鉴定遗传稳定性,3.4.1原生质体制备,食品学院2009级研究生开题报告,3.4.1原生质体制备,实验方法,1.酶解温度对原生质体制备的影响,2.酶浓度对原生质体制备的影响,3.酶解时间对原生质体制备的影响,4.正交实验确定原生质体制备的最佳条件,食品学院2009级研究生开题报告,实验方法,3.4.2原生质体融合,取两亲株原生质体悬浮液各lml混合，3500r/min离心15分钟。弃去上清液，缓慢加入预热1.8ml10%PEG6000溶液和0.2ml的新生磷酸钙溶液，融合30min，混合均匀.立即加入SMM终止反应，3500r/min离心10min去除融合液，SMM高渗缓冲液离心洗涤两次后，重悬于SMM液中，用SMM高渗透压缓冲液稀释10倍后，取0.1ml用夹层法培养于再生基本培养块平板上，培养7天观察记数取单亲株及混合后不加PEG的原生质体分别作对照试验。,3.3.4.1融合子的检出将PEG处理好的原生质体作适当稀释，先涂布在再生平板上，使亲株及重组子都生长出菌落，然后用影印法复制到含抗性的培养基上，此后长出的菌落即为融合株。3.3.4.2融合子的鉴定稳定性鉴定菌落特征比较融合子与亲本菌株的拮抗试验酶活性的测定,实验方法,3.3.4融合子的检出及鉴定,实验方法,四.试验研究实施方案和进度,2.研究计划及预期进展,食品学院2009级研究生开题报告,五.试验研究预期效果,2.确定酶活性测定方法,2010年4月2010年9月相关的资料查找与准备工作。2010年10月2010年12月菌株诱变，选育高产酶枯草押宝菌株。2011年1月2011年7月全基因组改组技术的研究。2011年8月2012年3月对实验数据进行总结，拟写毕业论文。,1）从全基因整合构建多益生功能菌株，将具有多种益生性状整合到一个菌株，为开发性能稳