传染病病原诊断技术

.,传染病病原体的诊断技术,上海市（复旦大学附属）公共卫生中心应急检测实验室胡芸文,.,FriendorFoe?,Rotavirus,Ebolavirus,Bacterium,Algae,Protozoan,Virus,.,.,1973年以来部分新发的传染病,1973轮状病毒婴儿腹泻的主要病因1975细小病毒B195号病，慢性溶血性贫血的再障危象1976隐孢子虫隐孢子虫病，急性小肠结肠炎1977埃博拉病毒埃博拉出血热1977嗜肺军团菌军团病1977汉坦病毒肾综合征出血热1977空肠弯曲杆菌空肠弯曲菌肠炎1977丁型肝炎病毒丁型肝炎1980嗜人T细胞病毒I型T细胞淋巴瘤白血病1981金黄色葡萄球菌产毒株中毒性休克综合征1982大肠埃希菌O157：H7出血性结肠炎1982嗜人T细胞病毒11型毛细胞白血病1982伯氏疏螺旋体莱姆病1983人类免疫缺陷病毒艾滋病(HIV),.,1973年以来部分新发的传染病(续),1983幽门螺杆菌消化性溃疡病1986环孢子球虫环型孢子虫病(顽固性腹泻)1988人疱疹病毒6型突发性玫瑰疹1989丙型肝炎病毒丙型肝炎1990戊型肝炎病毒戊型肝炎19920139霍乱弧菌O139霍乱1992巴尔道氏体猫抓病，杆菌性血管瘤病1993汉坦病毒分离株汉坦病毒肺综合征1994Sabia病毒巴西出血热1994新变异型克雅氏病(人类疯牛病)1985年疯牛病（牛海绵状脑炎BSE）-1994年出现首例nvCJD-1996年提出nvCJD概念病原为朊蛋白PrP（英）1995庚型肝炎病毒庚型肝炎1997H5N1禽流感病毒人禽流感1998Nipah病毒尼巴病毒性脑炎1999西尼罗病毒西尼罗病毒性脑炎2000裂谷热(RiftValley)病毒裂谷热2003SARS冠状病毒SARS（传染性非典型肺炎）,.,大部分人类致命性疾病均是由动物传播，包括现正肆虐全球的禽流感。每年至少有一种新病原体，包括病毒、细菌、寄生虫、原生动物和真菌等从动物传染给人类。前所未有的速度产生突变，并传给人类，就如艾滋病、马尔堡出血热、SARS以及现正肆虐全球的禽流感等难抗病毒。研究人员分辨1407种令人类生病的病原体，发现其中至少800种越过种物界线，由动物传至人类。,新发传染病动物传播,.,与人类行为及环境的改变有关,过去25年来曾出现38种新病原体袭击人类，其中四分三为源自动物的疾病，包括艾滋病、马尔堡出血热、SARS及禽流感等。丛林打猎、密集耕种、全球变暖及长途旅行的普及，增加疾病跨种物传播的机会，使动物身体上的病原体容易产生突变，感染人类。一个典型例子是艾滋病毒，最初原是在非洲猿猴身上发现的一种病毒，其后传播至人类身上，更演变成世纪绝症。,.,新病原体的特征,现时人类新传染病的病原体，多属于核糖核酸(RNA)病毒类，包括艾滋病毒及流感病毒，可于短时间内发生突变，并容易适应新宿主，令跨种物传播机会变得更大。,.,人类与传染病较量中的四方面重大突破,隔离检疫制度的建立;病原微生物的发现;特效药物的出现;疫苗的诞生.,.,快速诊断是关键,在人类与传染病的斗争中，诊断、治疗和预防是三个关键环节。其中，及时正确诊断最为关键，是有效治疗的基础，也是制定预防策略的依据。及时发现、有效鉴别、快速诊断和提出预警，这是现代传染病防治体系的最前沿对已知传染病要尽快明确诊断对未知新发传染病要查病因,.,传染病的实验室诊断,一般检查;生化检查;病原学检查;免疫学检查;病理组织检查;影像学检查.,.,传统的和常规的病原学诊断,分离培养(细胞,组织动物);显微镜检查(光学和电子显微镜);抗原成分检测(ELISA,免疫荧光等);分子生物学基因诊断(核酸杂交,PCR等);,.,Electronmicrographs,Adenovirus,Rotavirus,(courtesyofLindaStannard,UniversityofCapeTown,S.A.),.,免疫荧光检测,Positiveimmunofluorescencetestforrabiesvirusantigen.(Source:CDC),(VirologyLaboratory,Yale-NewHavenHospital),.,细胞病变效应(cpe),Someviruseskillthecellsinwhichtheyreplicate,ofteneasilyvisibleascpe,othervirusesproducelittleornocpeTypicallyroundingordetachingofcellsandcellfusion(syncytia),FromPrinciplesofVirology,FlintetalASMpress,FromPrinciplesofVirology,FlintetalASMpress,.,实验动物,Laboratoryanimals-animalmodelsofhumaninfection.Historicallytheonlywaytostudyviruseswasfromanimaltoanimal.Problems-1)inconvenientandexpensive,2)notadefinedsystem-leadstogenerationofvirusmutants,3)animalwelfareissues,Advantages-1)somevirusescanonlybestudiedinthisway,2)givesuniqueinsightintoviruspathogenesisEmbryonatedeggs,FromPrinciplesofVirology,FlintetalASMpress,.,核酸诊断的发展史,核酸分子杂交聚合酶链反应（PCR）核酸定量分析,核酸的直接检测核酸扩增检测(PCR)定性PCR定量PCR,.,核酸分子杂交(nucleicacidmoleculahybridization),genome,probe,32P35S3H125I生物素地高辛酶,genome,genome,genome,probe,probe,probe,检测方法：放射自显影底物显色化学发光,.,常用核酸分子杂交技术,斑点杂交（spotblothybridization)凝胶电泳印迹转移杂交（Southernblothybridization)原位杂交（in-situhybridization),.,聚合酶链反应（PCR）,基本步骤和原理,变性（高温）,退火（低温）,延伸（适温）,每一循环,模板,引物,引物,dATPdGTPdTTPdCTPTaq酶,.,PCR原理和步骤,.,定量PCR-荧光实时定量PCR,Taqman水解探针法杂交双探针法分子信标（环性探针）法Amplisensor能量转换法等,.,新发传染病的病原体？,.,病原学发现的“科赫三定律”,一、每种传染病必定能发现其病原体；二、能培养出该病原体的纯种；三、以培养出的纯种病原体接种于动物可以产生相同的病变。,.,建立该病原体的鉴定方法,动物试验临床实验室诊断流行病学研究等,分离到该病原体,确定一种疾病病原体的基本步骤,最终确定病原体与疾病的病因学关系,.,基本思路,回答两个问题：是否是已知的病原体或其变种？是否是完全未知的一种病原体？基本要求：快、准,.,已知病原体的快速诊断,高通量的检测技术,.,高通量的病原体筛选技术,病原体核酸的高通量检测技术一：多重PCR（联用技术：质谱技术、液相芯片技术）技术二：病原体基因芯片病原体抗原或抗体的高通量检测核心技术：蛋白质芯片,.,MultiplexPCR-MassTagsystem,多重PCR-质谱联用技术,.,美国哥伦比亚大学Lipkin研究组发明了一种基于multiplexPCR-MassTag（多重PCR与质谱联用）的高通量病原体快速筛选技术。优点：由于使用光敏感的分子量标签，增强了multiplexPCR引物设计的适应性和灵活性，使检测通量有大幅度的提高。应用质谱分析PCR产物上的分子量标签克服了凝胶电泳分辨率的局限或荧光染料种类的局限。,.,1.PCRamplificationwithconjugatedprimers90minutes,2.PCRpurificationonfilterplate30minutes,3.Elutioninto96-wellloadingplateformassspectrometeranalysis,96-wellthermocyclerplate,B,A,4.Automatedsampleinjection,photocleavageanddetection1:30minutes/sample,Purifiedsamples,UltravioletLight,Cleavageofmasstagsfromamplicon,MS,B,A,B,A,B,A,B,A,B,A,B,A,Ionizationanddetection,A,B,5.Identificationofpathogenbysignalanalysis,PCR-MassTagsystem,.,NUCLEICACIDCONJUGATEDMASSTAGS,Photocleavablelinkerandspacer,MSsensitivityenhancer,Variablemassunit,.,DETECTIONOF58DIFFERENTMASSTAGSBYAPCI-MS,.,目前，建立在此技术上的有呼吸道病原体检测模块（包括19个病毒和3种细菌），流感病毒亚型检测模块，出血热病原体检测模块，痘疹病毒检测模块和脑炎脑膜炎病原体检测模块。尽管目前已开发的分子量标签只有64个，但根据质谱分析的分子量范围，还可有极大的拓展空间，保证了这一技术具有足够的发展前景和潜力。,应用,.,RESPIRATORYSYNDROMEPANEL,InfluenzaAMatrixInfluenzaAN1InfluenzaAN2InfluenzaAH1InfluenzaAH2InfluenzaAH3InfluenzaAH5InfluenzaBHARSVGroupARSVGroupB,MetapneumovirusEuropeanstrainsAmericanstrainsCoV-SARSCoV-OC43CoV-229EHPIV-1HPIV-2HPIV-3HPIV-4HPIV-4aHPIV-4bChlamydiapneumoniaeMycoplasmapneumoniaeLegionellapneumophilaStreptococcuspneumoniaeHaemophilusinfluenzae,InfluenzaAH7RhinovirusHerpesSimplexVirus1,2VaricellaZosterVirusCytomegalovirusHIV-1HIV-2MeaslesvirusMycobacteriumtuberculosisPneumocystiscariniiCoxiellaburnetti,CurrentRespiratoryPanel,InProgress,EnterovirusAdenovirus,.,HEMORRHAGICFEVERPANEL,Ebolavirus(Zaire)Ebolavirus(Sudan)MarburgvirusCrimean-CongohemorrhagicfevervirusRiftValleyvirusHantaanvirusSeoulvirusYellowFeverKyasanurForestvirusLassavirus(lineageIV),Ebolavirus(Reston)JuninvirusMachupovirusDobravavirusTacaribevirusGuanaritovirusSabiavirusLCMVChikungunyavirusDenguevirusgroupBorreliaburgdorferiHerpesSimplexvirus(1,2)HIV-1,-2NeisseriameningitidisRickettsiaSpottedFeverGroupPlasmodiumsp,CurrentPanel,InProgress,.,A,C,B,LabNetwork,EpidemiologyMicrobiologyresearchservicetraining,infectiousagents,samplesclinicaldata,GLOBALSURVEILLANCENETWORK,Animalmodelsdrugsvaccines,Drosten,HamburgLipkin,NewYorkMackenzie,PerthPauli,BerlinPeiris,HongKongQian,BeijingPerez-Brena,MadridSwanepoel,SouthAfricaWebster,MemphisWen,Shanghai,.,MultiplexPCR-XMAP,多重PCR-液芯联用技术,.,Diagram,LUMINEXXMAP技术：多指标并行检测系统（流式荧光技术或液芯技术）,技术,GENOCATemplexPCR技术:多指标并行扩增,.,SuperPrimer,TemplexPCR技术原理,.,TemplexPCR技术原理,.,巢示PCR引物提高了引物间的相容性低浓度的特异性引物降低了反应过程中的背景值.仅有的一条生物素标记的引物使得更容易扩大生产以及质量控制.,.,流式荧光技术（液芯）原理XMAP,荧光编码微球技术,.,每种微球的地址由两种红色荧光颜料的掺入比例唯一决定,颜色编码的微球,.,共价交联技术,.,反应模式,.,MultiplexAssayswithColorSeparetion,.,Luminex100多功能流式点阵仪,流式荧光检测仪,.,呼吸道感染型11种DNA基因组的病原体,.,呼吸道感染型13种RNA基因组病毒型病原体,.,蛋白质芯片,MASATM液相芯片,.,一.基本原理微小的乳胶颗粒（Beads,微球）分别染成不同的荧光色，然后再把针对不同检测物的蛋白（如抗原抗体）以共价方式结合到特定颜色的微球上。应用时，先把针对不同检测物的、用不同颜色编码的微球混合，再加入被检测物（被测物可以是血清中的抗原、抗体、或酶等）。,.,固定生物分子的微球,.,悬浮点阵,多分析物组合灵活,.,TheRedLaserisUsedtoIdentifytheBeadCode,TheGreenLaserisUsedtoIdentifytheReporterSignal,.,液相芯片的特点：液相芯片的独特设计使得它拥有常规的蛋白质检测方法所不具备的特点：1.重复性好2.通量大可对同一样本中的多种不同目的分子同时进行分析在35-60分钟内可对96个不同样本进行检测。,.,3.灵活性好4.灵敏度高5.信噪比好6.操作简便，不需洗涤，耗时短7.液相环境更有利于保持蛋白质的天然构象，也更有利于探针和被检测物的反应,.,HybridizationTime,%ofMaximum,Minutes,.,MASATM和ELISA灵敏度的比较,.,基因芯片（GeneChip）,何谓基因芯片：基因芯片（或DNAChip,或Microarray）又称DNA微阵列，是指固定在固相载体上的高密度DNA微点阵。即将大量靶基因或寡核苷酸片段有序地，高密度地（点与点间距一般小于500m）排列在玻璃、硅等载体上，称之为基因芯片。基因芯片的种类：按应用，基因芯片主要可分为3类：1、表达谱基因芯片：主要用于基因功能研究；2、诊断基因芯片：如肝癌诊断芯片、糖尿病诊断芯片、病原体多基因诊断芯片等：3、检测芯片：如商品检疫芯片、病原体检测芯片等。,.,ViralPathogenCustomMicroarray,病原体诊断基因芯片,.,.,HighSensitivityScanner,0.05CPSMCPSM-whatdoesitmean?Chromphorespersquaremicron0.05cpsmor5moleculesofdyeper10micronpixel.Competitorsbestis10moleculesofdyeper10micronpixel.Toachievehighsensitivity:DynamicAutofocusLaserstabilityControlHighresolutionscanning,0.05CPSM,Detect5dyemoleculesin10umpixel,0.1CPSM,Detect10dyemoleculesin10umpixel,.,eArrayDeliveringCustomContentandFormats,Back,NameYourDesign,SelectArrayFormat,.,ProkaryoticArrayCustomDesigns,AgrobacteriumAnopheles(AG)andPlasmodium(PB).ie.malariamicroarrayArchaeon,Halobacteriumsp.BacilluscereusBacterialpathogensBifidobacteriumlongumBordetellaPertussisChlamydophilaabortusCulexpipiensCyanobacteriumSynechocystisE.ColiErwiniacarotovoraatroseptica/SolanumtuberosumLactobacillusplantarumMethylobacteriumextorquensAM1PlasmodiumfalciparumPseudomonasaeruginosaS.aureus;N.meningococcus;E.coliSalmonellatyphimuriumStaphylococcusaureus,.,SARSCoronavirus,.,HumanCoronavirusOC43,.,HumanCoronavirus229E,.,GreeneChip1.1,Sample:WNVNY99100,000RNAcopies/ml32/45tophitsareWNV-specific;remainderareJEVgrouporotherflavivirus-genusprobes,CollaborationbetweentheGreeneLaboratoryofColumbiaUniversity,ICTV,NortheastBiodefenseCenter,andAgilentCorporation,.,Sample:SARS-CoV100,000RNAcopies/ml,GreeneChip1.1,Columbia(Briese,Lipkin,Liu,LussierPalacios),ICTV(Bchen-Osmond),andAgilent(Hirschberg)251,000sequencedatabase,1710vertebrateviruses,.,未知新病原体的发现,.,发现新病毒的主要技术路线,表达cDNA文库筛选技术宽范围PCR（基于保守序列的PCR）差异显示技术：代表性差异分析（RDA）抑制性消减杂交（SSH）序列非依赖的扩增：随机PCR（randomePCR）序列非依赖的单引物扩增（SISPA）,.,.,cDNA文库筛选,cDNA文库筛选常被用来检出RNA病毒的核酸。收集病毒颗粒（感染组织匀浆过滤，或者血浆超速离心以收集病毒颗粒），提取RNA，逆转录成cDNA,构成cDNA表达文库。最常用的表达型载体是gt11,插入的cDNA片断可以融合蛋白形式表达，保留抗原性。病毒在感染过程刺激机体产生特异性抗体，因而常用患者恢复期的血清对cDNA库进行免疫学筛选。,.,HCV的发现,1989年Choo等小组从被感染的黑猩猩的血浆中用超离心的方法收集病毒颗粒，提取核酸（包括RNA和DNA），充分变性后逆转录cDNA，构建gt11cDNA表达文库。用慢性非甲非乙肝炎患者的血清筛选库，结果得到一个反应性克隆。该cDNA克隆与正常人的DNA不杂交，说明他来源于外源基因组。与被感染黑猩猩的肝组织RNA杂交，与未感染黑猩猩的肝组织RNA不杂交，提示该因子可能就是输血相关肝炎的一种致病因子。发现该cDNA克隆仅与被感染黑猩猩的肝组织RNA杂交，而与DNA不杂交，提示该因子是一种RNA病毒。序列分析表明属于黄病毒科，命名为HCV。,.,基于保守序列的聚合酶链式反应（ConsensusSequenceBasedPCR）,基本原理：基于保守序列的聚合酶链式反应（以下简称保守序列PCR）就是通过已知的一种生物和另一种生物之间高度保守的DNA序列设计引物，用PCR的方法去扩增另一种生物的未知DNA序列。当一种未知病毒与可能与另一种已知的病毒相似时，可以根据已知病毒的保守序列设计引物，然后用PCR方法扩增出未知病毒的相应序列。,.,新型汉坦病毒的发现,1993年5月，在美国西南部爆发了一场高死亡率的急性呼吸道疾病。血清学试验中发现。病人的血清能与一些已知的汉坦病毒抗原起交叉反应，提示该病的病原体有可能是一种以前未能发现的新汉坦病毒。1993年Nichol等根据已知的汉坦病毒基因组M片断的包膜糖蛋白G2编码区的保守部位设计了PCR引物，扩增出一个278bp的DNA片断。序列分析表明，与其他个血清型的汉坦病毒至少有30%的不同源性，在系统发生上与IV型希望山病毒（ProspectHillvirus,PH）最为接近，说明该病毒是一种新的汉坦病毒。,.,基于保守序列的PCR,技术要点-引物设计一种是简并PCR，其所用的是一个混合的引物库，包含了已知某种病毒高度保守氨基酸区域的所有可能的核苷酸序列（设计引物之前，列出该病毒家族所有成员的对比图），但简并度很高时有效引物的浓度不足。另一种是根据密码子的偏向性设计单一的引物：依照高度保守的氨基酸序列，选择每个氨基酸最常用的密码子组成一条完整的引物。适用于分离亲缘关系较近的相关序列，但对亲缘关系较远的序列则不能检出。,.,简并引物设计,目前已经可以有计算机软件来设计，常用的软件有:PrimoDegenerate3.4GenefisherCODEHOPSimpledegenerateprimer(U:Oregon),.,差异显示技术（differentialdisplay),最先是Liang和Pardee等提出用于比较两种细胞或同种细胞在不同状态下mRNA表达差异的技术;现在已经发展了多种分离和鉴定差别表达基因的技术，其中代表性差异技术(RDA)和抑制消减杂交技术(SSH)以其灵敏度高、假阳性率低和重复性好而相对更受欢迎,.,代表性差异分析（RepresentationalDifferenceAnalysis,RDA）,基本原理：病原微生物感染靶器官或组织时，同时带入自己的基因组，这样病理组织就比正常组织多出了病原体基因组。RDA可以把单拷贝的外源基因组从高度复杂的人染色体DNA本底中检测出来。,.,RDA流程,分别提取实验组(Tester)和对照组(Driver或驱动子)的总RNA或者DNA用四碱基内切酶充分酶切，分别连上寡核苷酸接头，并用特异性的接头引物扩增扩增产物去除接头，再在实验组扩增子上连上新接头，将两份扩增子杂交，以新接头为引物进行扩增只有那些未能与驱动扩增子杂交而自身退火的样品DNA的两端因都能与引物配对才以指数形式扩增，而待检样品单链DNA和驱动样品DNA只有一端与引物配对而线性扩增,.,GBV病毒的发现,GB肝炎是Deinhardt等在1970年首先报道。后研究表明GB肝炎因子不同于甲-戊型肝炎病毒。1995年Simons等用GB肝炎因子感染狨猴取同一狨猴感染前和感染后急性期的血浆，分别提取总RNA，逆转录成cDNA作RDA分析，7个cDNA克隆序列分析表明，属于两种黄病毒，与HCV有一定同源性命名为GBV-A和GBV-B。,.,RDA的缺点,其本身不能消除不同mRNA分子丰度的差异,因而往往需要进行多轮杂交而每轮杂交都涉及到接头的连接和去除效率问题以及绿豆核酸酶消化去除单链等操作,.,抑制性消减杂交技术（SSH）,1996年Diatchenko等将抑制性PCR和减法杂交结合起来，创立了SSH技术。该技术通过接头特异性的引物选择性地扩增差异表达基因片段的同时，可以抑制非靶片段的扩增。利用杂交二级动力学原理巧妙地在减法杂交过程中消除了不同mRNA分子间丰度的差异，因而通过一次减法杂交可将差异片段富集1000倍以上。一般只需两轮杂交，3-4天即可得到几十或上百个差异片段,.,SSH的基本步骤,.,RDA与SSH,原理相似：都是建立在PCR技术和减法杂交的基础上。RDA是先对样品的cDNA进行扩增再杂交，而SSH则是先减法杂交再扩增。两者都具有高效、重复性好、阳性率高等优点。共同的缺点：由于驱赶子和待检测的标本的背景往往不完全相同，富集的差异片段可能不是微生物学鉴别的有用标记。,.,最新的技术,序列非依赖的扩增法：随机PCR(randomPCR)技术序列非依赖的单引物扩增(SISPA:sequenceindependentsingleprimeramplification）,.,RandomPCR,基本原理：在合成随机引物时在其加上一个相同的接头，这个接头含有一个限制性的酶切位点可以便于随后的片断克隆进载体，然后对插入序列测序并进行BLAST比对即可初步获得未知病毒的种系来源信息。这种随机PCR法不仅可以检出DNA病毒也可以检出RNA病毒。利用这种方法Allander等在2005年在呼吸道感染的标本中发现了一种人的parvovirus；StangA等也在2005年使用这种方法在慢性疲劳综合症的病人漱口液中意外检测出了HSV-1型病毒。,.,SISPA,SISPA是单引物扩增法中最常用的一种