NG2与少突状胶质细胞

.,在EAE中，NG2与神经炎症、血脑屏障改变、OPCs反应及DCs激活有关,影响因子：12.213Accepted:15March2016,.,Moransard等人研究EAE在NG2KOmice的作用，发现与WTmice并没有发现任何差异而本作者采用通过样的方法，发现NG2在EAE中发挥着重要的作用,.,实验方法工具,1.ELISA-酶联免疫吸附试验2.EAE建模方法3.工具鼠4.bonemarrowchimeramouse5.血管内皮通透性试验,.,1.ELISA-酶联免疫吸附试验,.,OD,.,2.EAE建模方法,EAE模型是中枢神经系统内小血管周围出现单核细胞浸润及髓鞘脱失为特征的自身免疫性疾病，是人类多发性硬化（MS）的理想动物模型。雌鼠步骤：MOG35-55(200ug)+PBS水溶液100ulH37RA(结核分枝杆菌300ug)+然后300ul不完全弗氏佐剂超声乳化尾静脉一次每只0.1ml+百日咳病毒（原液400ng/ul)用PBS稀释使用,每只老鼠腹腔注射0.1ml，第2天注射。,皮下两侧尾静脉,.,利用同源重组技术WTC57Bl/6JmiceF1NG2+/-MiceF2NG2-/-Mice&NG2+/+MiceWTMice纯合的NG2KOmice,3.工具鼠,theinsertionofa1100-bpneomycin-resistance,.,F1,.,WT,.,4.bonemarrowchimeramouse,骨髓嵌合体小鼠=淋巴造血系统嵌合体=放射性嵌合体彻底破坏受者机体骨髓的造血系统，最大程度的杀灭肿瘤细胞骨髓含造血干细胞，血液也有白血病同基因型,.,5.FITC-dextran,血管内皮通透性试验脑微血管内皮细胞（BMEC）拥有丰富的酶系统，但缺乏收缩蛋白，故正常生理状态下组胺、5-羟色胺、白三烯C4等血管活性物质较少影响血脑屏障而病理状态下因BMEC酶系统活性改变，活性物质将影响BMEC，从而进一步影响血脑屏障的通透性。开放的血脑屏障能让大分子如右旋糖酐通过,.,在EAE中，NG2与神经炎症、血脑屏障改变、OPCs反应及DCs激活有关,.,Introduction,1.NG2-硫酸软骨素蛋白多糖，OPCs和激活的周细胞表达，NG2、PDGFR是OPCs（NG2cell）的marker，当其分化成少突状胶质细胞时，这两个marker不表达CNS损伤时，OPCs反应性增殖，表达NG2的细胞在炎症部位聚集EAEandMS，急性期，OPC的数量显著增加，在慢性后期中，显著减少OPCs分化为少突状胶质细胞，促进髓鞘的生成CNS微血管中，周细胞促进血管生成，促进紧密连接的形成，从而保护BBB通透性和维持内皮细胞屏障的功能；CNS损伤时，充当炎症传感器，免疫监视，执行中性粒细胞巨噬细胞的功能,.,2.表明NG2与CNS损伤的炎症息息相关胶质瘢痕:由于缺氧、低血糖、感染、中毒等均能引起脑组织的损伤而导致星形胶质细胞增生。反应性星形胶质细胞增生是脑组织损伤的修补反应减弱星形胶质细胞增生，有利于改善脑缺血后神经功能恢复胶质瘢痕形成是一个极其复杂的病理生理过程，包括组织水肿、炎症反应、局部缺血、谷氨酸受体高反应性、脂质过氧化作用、钙离子超负荷、自由基损伤、反应性星形胶质细胞增生,.,EAEBBB渗透性改变的疾病3.NG2炎症浸润CNS损伤有关,.,4.NG2KOmice，EAE的临床表现型更轻微Unexpectedly，NG2有助于EAE的发病机制OPCs及周细胞表达NG2原因免疫细胞也表达NG2,.,Abstract,在成年人的CNS中，OPCs表达NG2在病理情况下，NG2是周细胞激活的markerEAEBBB渗透性改变的疾病NG2炎症浸润CNS损伤有关,.,1.在NG2KOmice中诱导EAE的发生相比WT,NG2KOmiceEAE临床评分更轻微OPCs的数量在EAE诱导后无改变2.发现NG2在免疫细胞中表达，如T细胞、巨噬细胞树突状细胞3.评估了T细胞致脑炎性物质WTNG2KOmice增殖的致脑炎物质MOG35-55水平相同However，NG2KOmiceT细胞反应偏向于Th2型反应4.是否分泌了炎性因子，联想到DCs，测定IL-12表达情况NG2KOmice中，IL-12-expressingCD11c+细胞显著减少更重要的是，在WTmice中，IL-12的表达在CD11c+NG2-cell比CD11c+NG2+cell要更少5.是否NG2与免疫系统和CNS水平有关-骨髓嵌合体老鼠相比接受WT骨髓的mice，接受NG2KOmice骨髓的，EAE症状更轻微,？,研究思路,.,Results,1.NG2KOmice的EAE表现型更轻微2.NG2KOmice骨髓中，EAE相关的炎症更轻微3.EAEinducedNG2KOmice，OPCs的数量无改变4.EAEinducedNG2KOmice，紧密蛋白的连续性分布与BBB功能有关5.免疫细胞表达NG26.NG2KOmice,T细胞对MOG反应，炎症较少7.NG2KOmice，IL-12表达较少&NG2参与DC的激活8.NG2不参与巨噬细胞的极化9.NG2KOmice,可调节的免疫反应&保守的BBB导致了EAE轻微的表现型,.,1.NG2KOmice的EAE表现型更轻微,Arepresentativeofthreeindependentexperimentsispresented,.,26/33100%=78.78%,diseaseincidence(844.5vs.100%inWTmice)Diseaseonsetwasdelayed(13.063.66vs.8.161.71daysforWTmice),Arepresentativeofthreeindependentexperimentsispresented,.,CD45：血管周浸润的炎性细胞，巨噬细胞CoIIIV:microvesselbasallaminaTO-PRO-3：细胞核,.,脊髓截面染色,小胶质细胞&巨噬细胞,激活的星形胶质细胞,Stressmarker-positivecells,浸润的T细胞,.,大脑皮层,脊髓,.,2.NG2KOmice骨髓中，EAE相关的炎症更轻微,EAE相关的促炎性基因的mRNA的表达情况,.,3.EAEinducedNG2KOmice，OPCs的数量无改变,EAEandMS，急性期，OPC的数量显著增加，在慢性后期中，显著减少（脱髓鞘过程中）WhetherNG2缺失影响少突状胶质细胞的免疫反应？首先要证明NG2是不存在的或不生成免疫荧光定量分析OPCs数量确定PDGFR确定NG2的确敲除了，且在NG2KOmice中不表达,.,EAE,.,theinsertionofa1100-bpneomycin-resistance,.,在NG2KOmice中，NG2特异性的信号没有被发现（基于NG2敲除的前提下，理解为没有生成），实验更加严谨-IFN-,EAE,研究NG2缺失,.,免疫荧光定量分析OPCs数量,.,MBP:神经纤维APP:损伤的轴突,.,4.EAEinducedNG2KOmice，紧密蛋白的连续性分布与BBB功能有关,周细胞：神经血管形成BBB功能NG2KOmice中，是否神经炎症水平降低与血脑屏障特异性改变有关研究了内皮细胞的紧密连接蛋白、claudin-5、occludin（咬合蛋白）的结构和功能的分布血脑屏障结构和功能的改变与紧密连接蛋白的表达变化有关,.,.,.,.,Dextran-FITCexperiments血管内皮通透性试验,NG2KOmice周细胞缺乏NG2影响TJs的动态组合可替换信号转导途径,.,5.免疫细胞表达NG2,NG2KOmice，巨噬细胞产生更少的炎性物质，浸润能力减弱NG2可能与其他炎性细胞浸润CNS有关，whetherNG2isexpressedinWTmiceornotbycellsofthesystemicimmunesystem.?TCellBMDDCsBMDMs,.,CD3:TCellCD11c：BMDDsCD11b:BMDMsDAPI：核酸，DNAAT区,?,.,6.NG2KOmice,T细胞对MOG反应，炎症较少,是否缺乏NG2的免疫细胞会影响疾病的表达情况观察TCell的增殖和细胞因子的表达情况ConA:+positive植物血凝素类多克隆刺激剂，通过细胞表面的CD3-TCR复合体作用于T细胞,对小鼠T细胞增殖作用更强一些单独anti-CD3包被在板上能刺激纯化T细胞增殖，加入anti-CD28作用更强PLP:-negativeMO35-55:EAE,.,6.NG2KOmice,T细胞对MOG反应，炎症较少,是否缺乏NG2的免疫细胞会影响疾病的表达情况观察TCell的增殖和细胞因子的表达情况ConA:+positive植物血凝素类多克隆刺激剂，通过细胞表面的CD3-TCR复合体作用于T细胞,对小鼠T细胞增殖作用更强一些单独anti-CD3包被在板上能刺激纯化T细胞增殖，加入anti-CD28作用更强PLP:-negativeMO35-55:EAE,.,6.NG2KOmice,T细胞对MOG反应，炎症较少,是否缺乏NG2的免疫细胞会影响疾病的表达情况观察TCell的增殖和细胞因子的表达情况ConA:+positive植物血凝素类多克隆刺激剂，通过细胞表面的CD3-TCR复合体作用于T细胞,对小鼠T细胞增殖作用更强一些单独anti-CD3包被在板上能刺激纯化T细胞增殖，加入anti-CD28作用更强PLP:-negativeMO35-55:EAE,.,6.NG2KOmice,T细胞对MOG反应，炎症较少,是否缺乏NG2的免疫细胞会影响疾病的表达情况观察TCell的增殖和细胞因子的表达情况ConA:+positive植物血凝素类多克隆刺激剂，通过细胞表面的CD3-TCR复合体作用于T细胞,对小鼠T细胞增殖作用更强一些单独anti-CD3包被在板上能刺激纯化T细胞增殖，加入anti-CD28作用更强PLP:-negativeMO35-55:EAE,.,抑炎,促炎,T增值情况,ConA-CD3-TCRConA-NG2-NG2,.,.,DCs髓系DCs：IL-12Th0Th1BMDDCs淋巴系DCs：IL-4Th0Th2,.,7.NG2KOmice，IL-12表达减少&NG2参与DC的激活,是否IL-12表达与NG2表达有关？,IL-12,WT,.,NG2-